2014 год

 

РЕЗУЛЬТАТЫ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ РАБОТ ПО «БАЗОВЫМ» ПРОЕКТАМ

Направление 53. Общая генетика

Изучены механизмы лигнификации у злаковых растений, связанные с их использованием в качестве возобновляемых источников различных ресурсов, как материальных (вискозное волокно и др.), так и энергетических (биотопливо). Показано: 1). Полиморфизм по локусу Aadh1 (ароматическая алкогольдегидрогеназа) у гексаплоидной мягкой пшеницы, также как у диплоидных пшениц, является функциональным, и оказывает влияние на признаки роста и развития растений. 2). Растения с генотипами FF и 00 по локусу Aadh1 у озимой мягкой пшеницы различаются по признакам, связанным с лигнификацией: толщине склеренхимного слоя, соотношению компонентов клеточной стенки и химическому составу лигнина (чл.-корр. РАСХН Н.П. Гончаров, д.б.н. А.А. Коновалов).

Длительный мониторинг сборов из Миасса позволил нам впервые документировать появление титульного вида комплекса Anopheles maculipennis в азиатской части России. Ранее этот вид отмечался только в локальностях России (СССР), расположенных намного западнее. Анализ совокупности имеющихся данных позволил проследить динамику расширения ареала вида Anopheles maculipennis с конца 1970-х годов. Расширение ареала этого вида на север и восток России связывается нами с эффектами глобального потепления (д.б.н., проф. И.К. Захаров, к.б.н. О.В. Ваулин).

Реконструирована  картина коэволюционных изменений ядерных и пластидных геномов у рода горох, согласно которой изменения пластидных геномов опережали изменение ядерного гена Scs1. Установлено, что закрепление стерильности и восстановление фертильности мягкой пшеницы на цитоплазме культурного ячменя сопровождается разнонаправленной изменчивостью митохондриальной и хлоропластной ДНК. Аллоплазматические линии мягкой пшеницы с цитоплазмой ячменя и восстановленной фертильностью могут служить исходным материалом для создания интрогрессивных форм пшеницы, устойчивых к грибным патогенам (д.б.н., проф. Л.А. Першина, к.б.н. В.С. Богданова).

Проведено изучение особенностей синапсиса, кроссинговера и транскрипционной инактивации хромосом у гибридов локальных хромосомных рас, подвидов и видов грызунов, различающихся по числу и типам фиксированных хромосомных перестроек. Впервые показано, что перицентрические инверсии не нарушают синапсис хромосом у гетерозигот, но приводят к перераспределению точек рекомбинации, в то время как гетерозиготность по робертсоновским транслокации вызывает задержки в спаривании хромосом и может приводить к специфичной для мейоза транскрипционной инактивации неспаренных хромосом и индуцировать апоптоз половых клеток (д.б.н., проф. Н.Б. Рубцов, д.б.н. П.М. Бородин).

Впервые получена физическая карта короткого плеча хромосомы 5В (5BS) мягкой пшеницы (размер плеча 290 млн. п.н.). Для локализации BAC-клонов на хромосому 5BS выполнены следующие работы: рестрикционное картирование (фингерпринтинг) ВАС-клонов (1); построение генетической и цитогенетической карты 5BS (2); скрининг ВАС- библиотеки маркерами (3). В результате работ из 43776 было отобрано и локализовано на хромосому 5BS 3161 ВАС-клонов, охватывающих приблизительно 89% длины плеча, в том числе и районы локализации хозяйственно-ценных генов (д.б.н., проф. Е.А. Салина, д.б.н. Е.А. Хлёсткина).

Методом функциональной магнитно-резонансной томографии (фМРТ) впервые показано, что запаховые стимулы противоположной модальности меняют активность нейронов в перекрывающихся областях обонятельных луковиц. Половые феромоны вызывают у самцов мышей положительный фМРТ ответ, а феромон стресса (2,5 диметилпиразин) – отрицательный ответ. Их совместное предъявление нивелирует нейрональную реакцию. Взаимоподавление хемосигналов на этапе первичной обработки указывает на возможность управления запаховой средой путем подбора ингибиторов, блокирующих восприятие неприятных запахов (д.б.н., проф. М.П. Мошкин).

Установлено, что эксайтотоксический эффект глутамата вовлечен в механизм программируемой гибели чувствительных к введению глюкокортикоидов клеток формирующегося мозга. Антагонист рецепторов этого нейротрансмиттера снижает число клеток, экспрессирующих активную каспазу-3, являющуюся показателем вступления клетки в апоптоз (чл.-корр. РАН, проф. Н.Н. Дыгало, к.б.н. П.Н. Меньшанов).

Установлено, что сигнальный путь инсулина/инсулиноподобных факторов роста взаимодействует с двумя стресс-связанными гормонами дрозофилы, дофамином и ювенильным гормоном, в контроле репродуктивной функции самок. Обнаружено, что ювенильный гормон опосредует влияние инсулинового сигнального пути на метаболизм дофамина и плодовитость: обработка ювенильным гормоном самок с подавленной экспрессией гена инсулинового рецептора InR в corpus allatum резко повышает количество откладываемых яиц и восстанавливает до уровня контроля активность ферментов метаболизма дофамина, дофамин-зависимой N-ацетилтрансферазы, щелочной фосфатазы и тирозингидроксилазы (акад. РАН, проф. Л.Н. Иванова, д.б.н. И.Ю. Раушенбах).

На селекционной модели гипертонической болезни человека – крысах линии НИСАГ с помощью микроматриц исследована транскрипционная активность генов почки. В корковом веществе почки выявлено 3 гена (Klk1, Klk1c10 и Kng1), участвующих в регуляции функции калликреин-кининовой системы (ККС), экспрессия которых практически заблокирована у гипертензивных крыс по сравнению с контрольными. Снижение уровня экспрессии этих генов и гена Gucy1a3 у гипертензивных крыс приводит к ослаблению функции ККС и к нарушению гемоциркуляции в почечных тельцах, что способствует развитию гипертензивного состояния. Таким образом, обнаружена новая мишень для возможных фармакологических воздействий с целью коррекции гипертензивного статуса  (д.б.н., проф. А.Л. Маркель, к.б.н. О.Е. Редина).

Направление 58. Молекулярная генетика, механизмы реализации генетической информации, биоинженерия

 Оценка генетического разнообразия геномов двух с лишним тысяч современных людей, представляющих около двухсот различных популяций мира, включая популяции Сибири, и прочтение полной последовательности геномов современных и древних людей впервые позволили получить свидетельства в пользу трехкомпонентного происхождения европейцев, предками которых являются западноевропейские охотники-собиратели, ранние европейские земледельцы и древние северо-евразийцы, связанные с населением Сибири эпохи верхнего палеолита. Относительный вклад трех древних компонент широко варьирует у современного населения Европы (чл.-корр. РАМН М.И. Воевода, к.б.н. О.Л. Посух).

Впервые выяснен тонкий механизм изменения сродства ТВР/ТАТА при полиморфизмах ТАТА-боксов промоторов 16-и генов, ассоциированных с различными заболеваниями человека, обусловленный изменением скоростей образования и распада комплексов ТВР/ТАТА, а также изменением времени их жизни.    В частности,  замена 31С→Т в ТАТА-боксе промотора гена интерлейкина 1β, ассоциированная с повышенным риском возникновения рака желудка и рака легкого, приводит к увеличению в 15.8 раз скорости образования комплексов ТВР/ТАТА, снижению в 3.7 раз скорости их распада и уменьшению более чем в 4 раза времени жизни, что свидетельствует об образовании менее прочных комплексов в условиях in vivo (д.б.н., проф. Т.И. Меркулова, к.б.н. Л.К. Савинкова).

Впервые показано, что электромагнитное излучение терагерцового диапазона селективно воздействует на экспрессию генов, кодирующих белки, при этом не вызывая термического стресса и не оказывая ДНК-повреждающего, генотоксического и мутагенного действия на эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) и геном бактерий (E.сoli). Показано, что ТГц-излучение активирует экспрессию генов систем защиты от окислительного стресса и избытка ионов металлов и не затрагивает систему детоксикации антибиотиков в бактериальных клетках, а также слабо модулирует синтез мРНК как в ЭСК, так и у E. сoli (к.б.н. С.Е. Пельтек).

Направление 60. Клеточная биология, теоретические основы клеточных технологий

Впервые была продемонстрирована локализация активно работающего CYP450 в клетках выделительной системы плоских червей. Полученные данные являются важным вкладом в исследования механизмов отношений паразит-хозяин и формирования лекарственной устойчивости гельминтов (д.б.н. В.А. Мордвинов, к.б.н. А.В. Катохин).

Получены  клетки  пациента  с  болезнью Альцгеймера, несущие мутацию в гене,  кодирующем  предшественник бета-амилоида и созданы генетические конструкции  CRISPR/Cas9,  что  позволит  создать линии индуцированных плюрипотентных   стволовых   клеток   человека,   моделирующие  данное заболевание,  и  изучать  его молекулярные механизмы. Установлено, что культивирование   плюрипотентных   клеток   человека   с  ингибиторами сигнальных путей дифференцировки способствует эффективному поддержанию плюрипотентности,   увеличивает   вероятность  реактивации  неактивной Х-хромосомы,    и   может   быть   использовано   для   стандартизации эпигенетических характеристик плюрипотентных клеток (д.б.н., проф. С.М. Закиян, к.б.н. А.И. Шевченко, к.б.н. С.П. Медведев).

Впервые показано, что в гибридных клетках типа ЭСК-фибробласт наблюдается альтернативное перепрограммирование родительских геномов, причем по принципу «все или ничего».  Согласно данным транскриптомного анализа оба альтернативных процесса перепрограммирования имеют общие черты, хотя гены, вовлеченные в эти процесса разные. 50-55% генов перепрограммируются «правильно», то есть их экспрессия меняется от неактивного состояния на активное и, наоборот, из неактивного в активное. Однако около 10% генов не перепрограммируются, то есть их экспрессия сохраняется на уровне родительской линии клеток, хотя сами гибридные клетки приобретают альтернативный фенотип  (д.б.н., проф. О.Л. Серов, к.б.н. Н.Р. Баттулин).

Направление 61.  Биофизика,  радиобиология, математические модели
в биологии, биоинформатика

Для анализа данных экспериментов ChIP-Seq для сайтов связывания транскрипционного фактора SF-1 были применены методы: (1) методы распознавания ССТФ SiteGA, oPWM и Sitecon; (2) de novo поиска мотивов (homer, http://homer.salk.edu/homer/). Пороги всех четырех методов установили с помощью экспериментальной проверки потенциальных ССТФ и сравнения распределений потенциальных сайтов для специфичной и неспецифичной выборок промоторов генов. Было показано, что большее число данных ChIP-Seq (до 80-90% в зависимости от высоты пика) определяется непосредственным взаимодействием SF-1 с ДНК (акад. РАН, проф. Н.А. Колчанов, к.б.н. Д.Ю. Ощепков).

 Направление 62.  Биотехнология

 Оптимизирована генетическая конструкция для экспрессии в клетках растений, включающая гены cfp10 и esat6 М. tuberculosis и ген dIFN человека путем введения СТВ-гена холерного токсина для усиления иммуногенности, фрагментов ДНК, кодирующих His6-последовательности для связывания с аффинными носителями и фрагмента KDEL, обеспечивающего защиту целевого белка от протеолитических ферментов. Создана генетическая конструкция phCas9 для конститутивной экспрессии рекомбинантных белков в клетках животных. Создан родоначальник линии мышей,  несущих в геноме трансген Cas9, который послужит платформой для осуществления направленного трансгенеза животных (д.б.н., проф. Е.В. Дейнеко, к.б.н. И.А. Серова).

Опубликованы 3 монографии, 4 главы в монографиях, 169 статей в отечественных журналах, 144 – в зарубежных изданиях, получено 3 патента на изобретение и 3 свидетельства о госрегистрации баз данных и компьютерных программ.


РЕЗУЛЬТАТЫ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ РАБОТ
ПО «БАЗОВЫМ» ПРОЕКТАМ

Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.1. Генетические основы эволюции и селекции: механизмы изменчивости, генетическое разнообразие и методы создания нового исходного материала для генетико-селекционных исследований (координатор акад. В.К. Шумный)

VI.53.1.1. Генетическое разнообразие возделываемых растений как основа эволюции и селекции (координатор чл.-корр. РАСХН Н.П. Гончаров)

Показано, что полиморфизм по локусу Aadh1 у мягкой пшеницы, также как у диплоидной пшеницы, является функциональным, и оказывает влияние на признаки роста и развития растений. Растения с генотипами FF и 00 по локусу Aadh1 (ароматическая алкогольдегидрогеназа) у озимой мягкой пшеницы различаются по толщине склеренхимного слоя, соотношению компонентов клеточной стенки (рис.1), химическому составу лигнина (рис. 2).

 

Рис. 2. Инфракрасный спектр лигнина Фрейденберга, после удаления полисахаридов, ОО - красная линия; FF - синяя линия

 

Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.1. Генетические основы эволюции и селекции: механизмы изменчивости, генетическое разнообразие и методы создания нового исходного материала для генетико-селекционных исследований (координатор акад. В.К. Шумный)

VI.53.1.2. Микроэволюционные процессы в популяциях видов разных таксонов (координатор д.б.н. И.К. Захаров)

Длительный мониторинг сборов из Миасса позволил нам впервые документировать появление титульного вида комплекса Anopheles maculipennis в азиатской части России (Novikov, Vaulin, 2014). Ранее этот вид отмечался только в локальностях России (СССР), расположенных намного западнее (White, 1978; Новиков, Алексеев, 1989). Анализ совокупности имеющихся данных позволил проследить динамику расширения ареала вида Anopheles maculipennis с конца 1970-х годов. Расширение ареала этого вида на север и восток России связывается нами с эффектами глобального потепления. Работа выполнена совместно с кафедрой цитологии и генетики Томского государственного университета.

Рис. 1. Расширение ареала малярийного комара Anopheles maculipennis.

Области: A – ареал Anopheles maculipennis по данным White, 1978;

B – расширение ареала вида, реконструированное по Новиков, Алексеев 1989;

С – расширение ареала вида до 2010 г. (Novikov, Vaulin, 2014 - Parasites & Vectors).


Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.1. Генетические основы эволюции и селекции: механизмы изменчивости, генетическое разнообразие и методы создания нового исходного материала для генетико-селекционных исследований (координатор акад. В.К. Шумный)

VI.53.1.3. Генетический контроль механизмов несовместимости между растениями разных таксонов и их адаптации к неблагоприятным условиям среды(координатор д.б.н. Л.А. Першина)

Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.1. Генетические основы эволюции и селекции: механизмы изменчивости, генетическое разнообразие и методы создания нового исходного материала для генетико-селекционных исследований (координатор акад. В.К. Шумный)

Блок 1.Реконструкция путей коэволюции ядерного и пластидного геномов в отношении их совместимости в роде Pisum   (Рук. Костерин О.Э.)

Ранее нами был обнаружен случай ядерно-цитоплазматического конфликта в отдаленных скрещиваниях гороха, связанный с несовместимостью пластид одной из форм дикого гороха с аллелями двух ядерных генов культурного гороха. Выяснилось, что ген Scs1, вследствие его конфликта с пластидным геномом в разных отдаленных скрещиваниях гороха, вызывает частичную стерильность гибридов. Нами была реконструирована  картина коэволюционных изменений ядерных и пластидных геномов у рода горох (Pisum). Согласно этой реконструкции, в эволюции гороха изменения пластидных геномов опережали изменение ядерного гена Scs1. При этом уникальное сочетание ядра и цитоплазмы некоторых форм гороха, включая горох абиссинский (P. abyssinicum), вероятно, возникло путем вторичной гибридизации ранее дивергированных форм.

Блок 2. Изучение особенностей проявления признаков фертильности и изменчивости митохондриальной и хлоропластной ДНК у аллоплазматических линий мягкой пшеницы, несущих цитоплазму видов ячменя H.vulgare и H.marinum и интрогрессированные в ядерный геном фрагменты чужеродных геномов. (Рук. Першина Л.А.)

Разработаны схемы получения  новых генетических моделей для изучения механизмов несовместимости/совместимости между цитоплазмой видов ячменя H.vulgare  (2n=14) и H.marinum ssp. gussoneanum  (2n=28) и ядерным геномом мягкой пшеницы T.aestivum  (2n=42). Получены новые данные, которые опровергают сложившееся в литературе представление о негативном влиянии цитоплазмы культурного ячменя на функционирование ядерного генома мягкой  пшеницы. Установлено, как и в случае классических  объектов – аллоплазматических линий мягкой пшеницы с цитоплазмой T.timopheevii, одни сорта мягкой пшеницы могут выполнять функцию закрепителей стерильности мягкой пшеницы на цитоплазме культурного ячменя, а другие сорта – восстановителей фертильности.  Показано, что у аллоплазматических рекомбинантных линий (H.vulgare)-T.aestivum  преобладание генетического материала сорта Саратовская 29 в ядерном геноме приводит к закреплению стерильности, а преобладание ядерного материала сорта Пиротрикс 2 – к восстановлению полной фертильности. Закрепление стерильности и восстановление фертильности сопровождается разнонаправленной изменчивостью митохондриальной (мт) и хлоропластной (хп)  ДНК. Так, у аллоплазматических линий (H.vulgare)-T.aestivum  с закрепленной стерильностью определенные районы мтДНК представлены как материнскими (ячменными), так и отцовскими (пшеничными) копиями. У линий (H.vulgare)-T.aestivum с восстановленной фертильностью преобладают копии пшеничного типа. Показано, что у аллоплазматических линий мягкой пшеницы, несущих цитоплазму ячменя и характеризующихся восстановлением полной фертильности, ядерно-цитоплазматическая совместимость не нарушается  при интрогрессии в ядерный геном короткого плеча хромосомы ржи 1RS.  

 

Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.1. Генетические основы эволюции и селекции: механизмы изменчивости, генетическое разнообразие и методы создания нового исходного материала для генетико-селекционных исследований (координатор акад. В.К. Шумный)

VI.53.1.4. Молекулярная и функциональная организация и эволюция хромосом эукариот (координатор д.б.н. Н.Б. Рубцов)

С помощью иммунофлуоресцентного анализа последовательных этапов мейотической конъюгации и  рекомбинации хромосом, вовлеченных в перестройки установлено, что перицентрические инверсии не нарушают синапсис хромосом у гетерозигот, но приводят к перераспределению точек рекомбинации, в то время как гетерозиготность по робертсоновским транслокации вызывает задержки в спаривании хромосом и может приводить к специфичной для мейоза транскрипционной инактивации неспаренных хромосом и индуцировать апоптоз половых клеток. 

Рис. 1. Распластанные препараты синаптонемых комплексов гибридов полевок Microtus mongolicus х  M.middendorffii (а) и М.  mongolicus х  M. gromovi (б-д). Стрелки показывают гетероморфные биваленты. Масштаб- 5µmю


Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.1. Генетические основы эволюции и селекции: механизмы изменчивости, генетическое разнообразие и методы создания нового исходного материала для генетико-селекционных исследований (координатор акад. В.К. Шумный)

VI.53.1.5. Геном злаков: изучение организации и вклада отдельных участков хромо-сом и генных локусов в проявление признаков и формообразование (координатор д.б.н. Е.А. Салина)

Впервые получена физическая карта короткого плеча хромосомы 5В мягкой пшеницы (размер генома 17000 млн.п.н.). Ключевым моментом для успешного секвенирования хромосом является построение физической карты, а именно, сборка ВАС-клонов в контиги и идентификация их расположения на хромосоме. Для построения физической карты была выбрана хромосома 5B, которая несет ряд генов, ответственных за хозяйственно-ценные признаки. Хромосома 5В имеет длину порядка 870 млн. п.н., из них на короткое плечо (5BS) приходится 290 млн.п.н. Для локализации BAC-клонов на хромосому 5BS (физическое картирование) выполнены следующие работы: рестрикционное картирование (фингерпринтинг) 43776 ВАС-клонов (1); построение генетической и цитогенетической карта 5BS с локализацией на них молекулярных маркеров в количестве 61 и 245, соответственно (2); скрининг ВАС- библиотеки маркерами (3). В результате работ из 43776 было отобрано 3161 перекрывающихся ВАС-клонов, которые покрывают 258 млн.п.н. хромосомы 5BS, что соответствует приблизительно 89% длины плеча. Скрининг ВАС-клонов с помощью молекулярных маркеров позволил локализовать на хромосому 5BS 31 суперконтиг из 1451 ВАС-клона (частично представлено на рис. 1).

Подход физического картирования, примененный для отдельных хромосом сложных геномов, таких как геном мягкой пшеницы, является основой как для секвенирования хозяйственно-ценных генов, так и для секвенирования de novo и последующего получения референсной последовательности всего генома.

Рис.1. Физическая карта короткого плеча хромосомы 5В (5BS). Вверху рисунка приведена генетическая карта 5BS, с расположенными на ней маркерами и контигами ВАС-клонов (ctg…, в скобках приведено число ВАС клонов в контиге). Положение маркеров указано слева-направо от теломеры к центромере (С). Детализированная схема контига ctg38 протяженностью 2400 тыс.п.н., с расположенными на ней ВАС-клонами, маркерами и генами (выделено красным), приведена внизу рисунка. Skr (ген скрещиваемости), Ssn3 (ген, определяющий чувствительность к септориозу).

 

Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.2. Молекулярно-генетические механизмы регуляции физиологических функций, поведения и процессов доместикации (координатор акад. Л.Н. Иванова)

VI.53.2.1. Иммуногенетические механизмы межорганизменных взаимодействий в репродуктивном цикле млекопитающих как фактор изменчивости потомков (координатор д.б.н. М.П. Мошкин)

Методом функциональной магнитно-резонансной томографии (фМРТ) впервые установлено, что рецепция запахов противоположной модальности может проецироваться в перекрывающиеся области обонятельных луковиц. При этом комплекс половых феромонов (моча эстральных самок) вызывает у самцов мышей положительный фМРТ ответ, а один из феромонов стресса (2,5 диметилпиразин) – отрицательный ответ. Совместное предъявление этих запахов нивелирует нейрональную реакцию (рис. 1). Таким образом, утрата стрессированными самками сигнальной привлекательности объясняется не только снижением экскреции половых феромонов, но и выработкой летучих соединений, подавляющих восприятие на этапе первичной обработки информации. Взаимоподавление хемосигналов указывает на возможность управления запаховой средой не только путем очистки воздуха от летучих соединений, но и путем подбора ингибиторов, блокирующих первичное восприятие запахов. 

Рис. 1. Реакция обонятельной луковицы самцов мышей на запахи разной сигнальной модальности. Левая панель: амплитуда фМРТ реакции (response, %), обксловленная увеличением потребления кислорода в ответ на стимул (blood oxygen level dependent - BOLD). Центральная панель: схема мышиной головы с указанием положения коронарного среза и фМРТ имиджи, отражающие реакцию нейронов обонятельной луковицы на запахи мочи эстральной самки, 2,5-диметилпиразин (2,5-ДМП) и их комбинацию. Правая панель: схема установки (томограф и разработанный в лаборатории дозатор запаховых стимулов), амплитуда фМРТ ответа (BOLD, %) на разные запахи. 

 

Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.2. Молекулярно-генетические механизмы регуляции физиологических функций, поведения и процессов доместикации (координатор акад. Л.Н. Иванова)

VI.53.2.2. Нейрогеномика психоповеденческих нарушений (координатор чл.-корр. РАН Н.Н. Дыгало)

Глюкокортикоидные гормоны в их числе и дексаметазон применяются для предотвращения респираторного дистресс синдрома новорожденных. Однако наряду с терапевтическим действием, эти гормоны индуцируют гибель клеток головного мозга еще во многом не ясными механизмами. Понимание этих механизмов необходимо для поиска путей преодоления негативных побочных эффектов гормонотерапии.

Установлено, что эксайтотоксический эффект возбуждающего нейротрансмиттера гутамата является компонентом механизма программируемой гибели чувствительных к введению глюкокортикоидов клеток формирующегося мозга. Об этом свидетельствует снижение антагонистом рецепторов глутамата числа клеток, экспрессирующих активную каспазу-3. Появление этой протеазы является показателем вступления клетки в процесс самоуничтожения по механизму программируемой гибели.

Рис. 1. AЧисло позитивных по активной каспазе-3 клеток в дорзальном субикулуме крысят после введения им дексаметазона (DEX), физиологического раствора (SAL), мемантина (5мг\кг - M5, 20 мг\кг -M20), мемантина в этих же дозах совместно с дексаметазоном (M5D и M20D) или без какого-либо введения (INT). *p < 0.05  и **p < 0.01 по сравнению с остальными группами. Б. Репрезентативные микрофотографии участков дорзального субикулума. Стрелками отмечены позитивные по активной каспазе-3 клетки. 

 

Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.2. Молекулярно-генетические механизмы регуляции физиологических функций, поведения и процессов доместикации (координатор акад. Л.Н. Иванова)

VI.53.2.3. Исследование генетико-физиологических и молекулярных механизмов нейроэндокринной регуляции висцеральных функций и поведения, обеспечивающих гомеостаз (координатор акад. Л.Н. Иванова)

Ювенильный гормон восстанавливает репродуктивную функцию (А) и метаболизм дофамина (активность ДА-зависимой N-ацетилтрансферазы (В) и щелочной фосфатазы (С)) у самок с нокдауном гена InR в corpus allatum (InR-). Значок ромб – достоверность отличий от самок InR-; звездочка – достоверность различий между нормой и тепловым стрессом внутри каждой группы.

Установлено, что влияние инсулинового сигнального пути на метаболизм дофамина и репродуктивную функцию дрозофилы опосредуется ювенильным гормоном: обработка ювенильным гормоном самок с нокдауном гена инсулинового рецептора (InR-) резко повышала плодовитость (А), восстанавливала активность дофамин-зависимой N-ацетилтрансферазы (ДАТ) (В) и стресс-реактивность до уровня контрольных самок InR+ (С).


Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.2. Молекулярно-генетические механизмы регуляции физиологических функций, поведения и процессов доместикации (координатор акад. Л.Н. Иванова)

VI.53.2.4. Молекулярно-генетические механизмы процесса доместикации, комплексных поведенческих, морфологических и физиологических признаков: экспериментальное исследование на селекционных моделях животных (координатор д.б.н. А.Л. Маркель)

Разработан метод регионального анализа ассоциаций в структурированных выборках, использующий технику ядерного сглаживания, примененную к гаплотипам в анализируемом регионе. Изучены статистические свойства этого метода и показано, что его мощность существенно зависит от качества восстановления гаплотипов.

Было проведено сравнение статистических свойств двух методов, использующих информацию о генотипах (SKAT) и гаплотипах (HKAT) при разных весовых функциях, дающих редким генотипам или гаплотипам ту или иную степень предпочтения. Мы показали, что при генетической неоднородности выборки мощность метода ядерного сглаживания, примененного к гаплотипам, ниже, чем соответствующего метода, использующего информацию о генотипах внутри региона (Рис. 1). Этот результат объясняется тем, что в случае генетически неоднородных выборок точность реконструкции гаплотипов низка, поскольку статистические методы восстановления гаплотипов базируются на предположении о генетической гомогенности выборки. Однако, последние достижения в области секвенирования экзома позволяют надеяться на доступность эмпирического, а не статистического, установления гаплотипов. В этом случае мощность регионального анализа ассоциаций, использующего информацию о гаплотипах, может оказаться выше, чем при анализе генотипов в регионе даже для генетически неоднородных выборок.

 

Рис. 1. Мощность регионального анализа ассоциаций в генетически гетерогенной выборке при использовании двух методов. По вертикали – мощность, по горизонтали – весовые функции: 1 – веса не зависят от частот генотипов или гаплотипов, 2 – редким вариантам или гаплотипам соответствуют большие веса, чем частым  (бета распределение весов генотипов описывается параметрами α = 0.5; b = 0.5; весовые функции гаплотипов описываются параметром k = 0.5), 3 – разница весов между редкими и частыми вариантами или гаплотипами еще более выражена (бета распределение весов генотипов описывается параметрами α = 1; b = 25, весовые функции гаплотипов описываются параметром k = 1).

 

Приоритетное направление VI.58. Молекулярная генетика. Механизмы реализации генетической информации. Биоинженерия. Программа VI.58.1. Механизмы регуляции экспрессии генов, сравнительные геномика и транскриптомика, фундаментальные основы нанобиоинженерии (координатор д.б.н. Т.И. Меркулова)

VI.58.1.1. Особенности формирования молекулярно-генетических механизмов метаболических нарушений и наследственных заболеваний у жителей Северной Азии и разработка новых подходов к их коррекции (координатор чл.-корр. РАМН М.И. Воевода)

На основе полного прочтения последовательности геномов из девяти останков древних людей, живших в Европе 7000-8000 лет назад, данных о генетическом разнообразии геномов двух с лишним тысяч (2345 образцов ДНК) современных людей, представляющих 203 различных популяций мира, и информации, полученной в результате секвенирования других древних и современных геномов, получены свидетельства в пользу трехкомпонентного происхождения европейцев. Предками современных европейцев являются 1) западноевропейские охотники-собиратели, потомки тех людей, которые пришли на этот континент около 40-45 тысяч лет назад; 2) ранние европейские земледельцы, пришедшие, в основном, с Ближнего Востока в эпоху неолита (7-8 тысяч лет назад) и 3) древние северо-евразийцы, связанные с населением Сибири эпохи верхнего палеолита. Относительный вклад этих трех древних компонент широко варьирует у различных представителей современного населения Европы.

 Рисунок.А. Модель трехкомпонентного происхождения европейских популяций. Б. Генетическое разнообразие современного человечества: генотипы 2345 людей из 203 популяций мира. В. Обложка журнала “Nature” (18 сент. 2014г) с иллюстрацией к статье Iosif Lazaridis et al. “Ancient human genomes suggest three ancestral populations for present-day Europeans” (doi: 10.1038/nature13673).


 

Приоритетное направление VI.58. Молекулярная генетика. Механизмы реализации генетической информации. Биоинженерия. Программа VI.58.1. Механизмы регуляции экспрессии генов, сравнительные геномика и транскриптомика, фундаментальные основы нанобиоинженерии (координатор д.б.н. Т.И. Меркулова)

VI.58.1.2. Молекулярно-генетические основы транскрипционной регуляции (координатор д.б.н. Т.И. Меркулова)

Впервые выяснен тонкий механизм изменения сродства ТВР/ТАТА при полиморфизмах ТАТА-боксов промоторов 16-и генов, ассоциированных с различными заболеваниями человека, обусловленный изменением скоростей образования и распада комплексов ТВР/ТАТА, а также изменением времени их жизни.    В частности,  замена 31С→Т в ТАТА-боксе промотора гена интерлейкина 1β, ассоциированная с повышенным риском возникновения рака желудка и рака легкого, приводит к увеличению в 15.8 раз скорости образования комплексов ТВР/ТАТА, снижению в 3.7 раз скорости их распада и уменьшению более чем в 4 раза времени жизни, что свидетельствует об образовании менее прочных комплексов в условиях in vivo. При этом наблюдается небольшое увеличение свободной энергии Гиббса за счет приближения последовательности ТАТА-бокса к канонической (табл.1и рис.1). IL 1b - провоспалительный цитокин, продуцируется главным образом моноцитами крови и макрофагами тканей и участвует в опосредовании острого и хронического воспаления, что может быть связано с его вовлеченностью в процессы опухолеобразования.  

 Таблица 1. Параметры комплексов ТВР/ТАТА

IL1 β

TATA-бокс

ka,M-1c

kd.c-1

t1/2min

KD, nM

∆G, kcal/mol

WT

CATAAAA

(1±0.1)x104

(2.1±0.5)x10-4

60±10

20±4

10.5±1.6

-31C>T

TATAAAA

(1.6±0.2)x105

(8±1)x10-4

14±2

4.8±0.6

11.3±1.5

 

Рис.1. Измерение скорости образования комплексов ТВР/ТАТА

 

Приоритетное направление VI.58. Молекулярная генетика. Механизмы реализации генетической информации. Биоинженерия. Программа VI.58.1. Механизмы регуляции экспрессии генов, сравнительные геномика и транскриптомика, фундаментальные основы нанобиоинженерии (координатор д.б.н. Т.И. Меркулова)

VI.58.1.3. Метаболомно-протеомное профилирование молекулярно-генетических систем и процессов (координатор к.б.н. С.Е. Пельтек)

С использованием рекомбинантных бактерий E. coli JM103 изучен ответ клеток на облучение терагерцовым излучением, а также на длительное культивирование в минимальной среде, облученной терагерцовым излучением. Выявлена активация промоторов генов katG и copA. Методом двумерного электрофореза белков с последующей масс-спектрометрией было выявлено 24 белка, экспрессия которых изменяется как минимум в два раза (р<0,01) при длительном культивировании клеток в облученной среде.

Анализ биохимических процессов, в которых участвуют эти белки показал, что происходит повышение экспрессии белков, связанных с процессами захвата и удержания железа клеткой: Ferrienterobactin receptor, Isochorismatase, Isochorismate synthase, NADPH-dependent ferric-chelate reductase. Экспрессия соответствующих генов регулируется транскрипционным фактором Fur, который при повышенной внутриклеточной концентрации железа Fe2+ ингибирует экспрессию генов (рисунок 1). 

 

Рисунок 1. Регуляция генов идентифицированных белков (в прямоугольниках) транскрипционными факторами (в кружках). Построено согласно базе EcoCyc. Красным обозначены гены, экспрессия которых повышается, зеленым - снижается в ответ на культивирование клеток в облученной среде. Красная линия обозначает ингибирование, зеленая стрелка- стимуляцию экспрессии.

 

VI.60.1.1. Молекулярные механизмы патологических процессов: роль описторхид в канцерогенезе (координатор д.б.н. В.А. Мордвинов)

В ходе выполнения проекта был установлен необычный факт - у всех паразитических видов плоских червей, в отличие от свободноживущих, система цитохромов Р450 представлена единственным геном. Роль этого уникального паразитического CYP450 в жизнедеятельности гельминтов пока остается загадкой, ответ на которую может пролить свет на ряд фундаментальных вопросов, связанных с проблемой функционирования метаболических систем паразитов в организме хозяина. В 2014 году впервые была продемонстрирована локализация активно работающего CYP450 в клетках выделительной системы плоских червей (рисунок). Полученные данные являются важным вкладом в исследования механизмов отношений паразит-хозяин и формирования лекарственной устойчивости гельминтов.

 

Рисунок. Локализация CYP450 активности (mCYP2B)  в выделительной системе гельминта O. felineus. Активно работающий фермент CYP в тканях образует флюоресцентный продукт в выделительных канальцах описторха. Это свидетельствуют об образовании продукта реакции монооксигеназ – резоруфина в клетках выделительной системы и активном участии CYP в системе экскреции. Кетоконазол является ингибитором микросомальных цитохромов, участвующих в метаболизме экзогенных соединений. При совместной обработки пентоксирезоруфином и кетоконазолом скопления флюоресцентных частиц почти полностью исчезают.  

 

Приоритетное направление VI.60. Клеточная биология. Теоретические основы клеточных технологий. Программа VI.60.1. Геномные и эпигенетические процессы  клеточной дифференцировки и разработка способов управления этими процессами (координатор д.б.н. О.Л. Серов)

VI.60.1.2.Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Эксперименталь-ное использование клеточных технологий для воспроизводства и коррекции патологических состояний (координатор д.б.н. С.М. Закиян)

Установлено, что культивирование плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) человека с ингибиторами гликоген-синтазы 3β (GSK3β) - CHIR99021 и митоген-активируемой протеинкиназы (ERK1/2) – PD0325901 способствует эффективному поддержанию плюрипотентного статуса и увеличивает вероятность реактивации неактивной Х-хромосомы. Добавление ингибиторов к ПСК в течение 3-5 пассажей приводит к снижению триметилирования H3K9 по всему геному и восстановлению на неактивной Х-хромосоме модификации активного хроматина H3K4me2 (Рис.2А). Дальнейшая реактивация Х-хромосомы, репрессия гена XIST, утрата триметилирования H3K27me3 и восстановление транскрипции генов происходит позже на 10-12 пассаже культивирования. (Рис. 2Б). Таким образом, данные вещества, вероятно, действуют не напрямую на регуляцию экспрессии гена XIST, а опосредовано благодаря глобальному снижению уровня триметилирования H3K9. При культивировании предшественников индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из клеток амниотической жидкости и плаценты, в среде, содержащей вещества CHIR99021 и PD0325901, наблюдается реактивация неактивной Х-хромосомы, которая происходит в клетках, не достигших плюрипотентного состояния.

 

 Рисунок. При культивировании ПСК человека в среде, содержащей CHIR99021 и PD0325901, на неактивной Х-хромосоме появляются модификации активного хроматина (H3K4me2, A), а на 10-12 пассаже (Б) наблюдается репрессия гена XIST и восстанавливается транскрипция Х-сцепленных генов (ChrХ). CЕР X – зонд, выявляющий Х-хромосому человека. Х-хромосомы указаны стрелками.

 

Приоритетное направление VI.60. Клеточная биология. Теоретические основы клеточных технологий. Программа VI.60.1. Геномные и эпигенетические процессы  клеточной дифференцировки и разработка способов управления этими процессами (координатор д.б.н. О.Л. Серов)

VI.60.1.3. Генетические и эпигенетические механизмы, регулирующие дифференцировку, трансдифференцировку и репрограммирование (координатор д.б.н. О.Л. Серов)

Впервые получены данные об альтернативном перепрограммировании родительских геномов в гибридных клетках, полученных слиянием эмбриональных стволовых (ЭС) клеток и фибробластов мыши. Транскриптомный анализ показал, что в альтернативное перепрограммирование, приводящее к становлению фенотипа ЭС клеток либо фибробластов, вовлечено более 3000 генов. Показано, что оба типа перепрограммирования имеют общие черты по количеству перепрограммированных, неперепрограммированных  и ошибочно перепрограммированных генов. Альтернативное перепрограммирование стартует на стадии гетерокариона и реализуется по принципу «все или ничего». 

 

Рисунок.  Профили экспрессии генов специфичных для ЭСК (D) и фибробластов (E) в клонах tme с фенотипом ЭСК и клона tmf с фенотипом фибробластов в сравнении с родительскими клетками. Видно, что профили 15 генов характерных для плюрипотентных клеток сходны в клонах серии tme и tauGFP родительской линии ЭС клеток, но разительно отличаются от фибробластов линии m5S и гибридных клеток серии tmf с фибробластным фенотипом. Обратная картина наблюдается при сравнении экспрессии генов специфичных для фибробластов в гибридных клетках серии tmf и клетках m5S, в которых видно сходство, но ничего общего с клетками tme клонов и ЭС клетками.  (E,G) Экспрессия некоторых генов, характерных для фибробластов сохраняется в гибридных клетках серии tmf, хотя они имеют фенотип ЭСК (Е) и, наоборот, в гибридных клетках серии tmf с фибробластным фенотипом сохраняется активность генов характерных для ЭСК (G). 

 

Приоритетное направление VI.61. Биофизика. Радиобиология. Математические модели в биологии. Биоинформатика. Программа VI.61.1. Молекулярно-генетические, биофизические, экосистемные и биосферные процессы: информационные системы, экспериментально-компьютерный анализ и моделирование (координаторы акад.
Н.А. Колчанов, акад. А.Г. Дегерменджи)

VI.61.1.1. Компьютерно-экспериментальное исследование и моделирование струк-турно-функциональной организации и эволюции генных сетей многоклеточных и одноклеточных организмов (координатор акад. Н.А. Колчанов)

Разработан экспериментально-теоретический подход верификации данных экспериментов ChIIP-Seq по массовому секвенированию сайтов связывания транскрипционных факторов (ССТФ). Для анализа двух экспериментов ChIP-Seq для ССТФ FoxA нами применены методы (1) методы распознавания ССТФ SiteGA, oPWM; (2) de novo поиска мотивов (ChIPMunk, diChIPMunk, http://autosome.ru/ChIPMunk/). Пороги всех четырех методов мы установили с помощью экспериментальной проверки 64 потенциальных ССТФ (метод EMSA оценки электрофоретической подвижности). Показано, что большее число данных ChIP-Seq (90-95% в зависимости от высоты пика, Рис.) определяется непосредственным взаимодействием FoxA с ДНК.

 

Рисунок. Эффективность раздельного и совместного применения методов ChIPMunk/SiteGA для распознавания ССТФ в данных эксперимента ChIP-Seq. Ось X – высота пика (при заданной высоте пика в анализ входили данные ChIP-Seq, в которых высота пика не менее указанного значения). Ось Y - доля пиков ChIP-Seq, содержащих предсказанные сайты. Розовый цвет означает долю пиков, в которых есть хотя бы один сайт предсказанный обоими методами в одной и той же позиции. Оранжевый цвет представляет долю пиков, в которых есть сайты предсказанные обоими методами в различных позициях. Зеленый/синий цвет означает долю пиков, в которых обнаружены сайты предсказанные только одним из методов.

 

Приоритетное направление VI.62. Биотехнология. Программа VI.62.1. Фундаментальные основы биотехнологий создания средств терапии и диагностики заболеваний (координатор акад. В.В. Власов)

VI.62.1.5. Разработка и совершенствование генетических конструкций для оптимизации экспрессии целевых генов и синтеза рекомбинантных белков медицинского назначения у трансгенных растений и животных (координатор д.б.н. Е.В. Дейнеко)

Оптимизирована созданная нами ранее генетическая конструкция, включающая гены cfp10 и esat6 М. tuberculosis и ген dIFN человека, предназначенная для экспрессии в клетках растений (а). Для усиления иммуногенности целевого рекомбинантного белка в генетическую конструкцию введен ген, кодирующий В-субъединицу холерного токсина (СТВ). Для связывания рекомбинантного белка с поверхностями аффинных носителей введены His6-фрагменты ДНК. Для защиты рекомбинантного белка от протеолитических растительных ферментов введен фрагмент KDEL, обеспечивающий его локализацию в люменах эндоплазматического ретикулума. С использованием созданных генетических конструкций получена серия трансгенных растений моркови. Создана линия трансгенных мышей №39, несущая ген Cas9 (б), которая послужит платформой для осуществления направленного трансгенеза у животных.

а – схема оптимизации генетической конструкции, предназначенной для получения трансгенных растений моркови. Обозначения: cfp10 – последовательность гена cfp10 M.tuberculosis; esat6 – последовательность гена esat6 M.tuberculosis; СTB-последовательность гена холерного токсина; dIFN - последовательность гена дельтаферона человека; His6 - последовательность фрагмента ДНК, обеспечивающего связывание рекомбинантного белка с поверхностями аффинных носителей; KDEL – фрагмент ДНК, обеспечивающий локализацию рекомбинантного белка в люменах эндоплазматического ретикулума; BamH1 и ХbaI -  сайты рестрикции; стрелками обозначены сайты посадки соответствующих пар праймеров.

б - ПЦР-анализ рожденных мышей линии Cas9.  Обозначения: 1, 24 – ДНК мышей, не несущих встройку трансгена; 39 - ДНК мыши, включающей экзогенную ДНК. К – отрицательный контроль, М – маркер молекулярного веса c шагом в 100 п.н.

Результаты научно-исследовательских работ
по программам Президиума РАН


Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН А.II.3 «Химические аспекты энергетики» (координатор – акад. И.И. Моисеев)

Проект 13. Поиск, селекция и изучение перспективных бактериальных штаммов-проду­центов для переработки глицерина (акад. Н.А. Колчанов, к.б.н. С.Е. Пельтек)

Проведен  метагеномный анализ суммарной ДНК образцов, отобранных в геотермальном источнике Термофильный (полуостров Камчатка) и озера Кротовая Ляга (Новосибирская область). Анализ последовательности ДНК позволил  найти гены, потенциально пригодные для совершенствования штаммов микроорганизмов, осуществляющих биоконверсию глицерина в ценные химические вещества (в том числе, 1,3-пропандиол). В результате исследования геотермальных источников Камчатки были обнаружены микроорганизмы, способные использовать глицерин в качестве единственного источника углерода:

1) Clostridium cellulosi - 0.3%, представляющий собой строгий анаэроб, гетеротроф, не способный к сульфатредукции. Оптимум его роста наблюдается при нейтральных значениях рН и температуре 55-60⁰С.

2) Eubacterium sp.- составлявший 0.1% от всех последовательностей. Кроме того, данные бактерии были обнаружены в цианобактериальном мате горячих источников Йеллоустонского парка США.

3) Clostridium symbiosum: - 0.1% от всех последовательностей.

4) Desulfotomaculum geothermicum strain DSM 3669: - 0.1% последовательностей. Представляют собой строгие анаэробы, гетеротрофные, водородокисляющие, сульфатредукторы.

Рис.1 Представленность таксонов микрорганизмов, обнаруживаемых в источнике Термофильный по данным метагеномного анализа. А. - точка У-5-3.

Таким образом, содержащиеся в образцах термофильные бактерии Clostridium cellulosi и Clostridium symbiosum могут быть выделены и использованы как потенциальные объекты для создания рекомбинантных микроорганизмов, перерабатывающих глицерин. Найдены варианты генов, кодирующих фермент глицерин дегидрогеназа (EC 1.1.1.6), отвечающий за способность бактерий использовать глицерин в качестве источника энергии. Таким образом,  была создан банк метагеномной ДНК, предназначенный для выделения как бактерий, так и целевых генов.

 

Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН А.II.5 «Фундаментальные науки – медицине» (координатор – акад. А.И. Григорьев)

Проект ФНМ-7. Разработка новых терапевтических подходов к защите нейронов от дегенерации при действии стресса и его гормонов – глюкокортикоидов (чл.-корр. РАН  Н.Н. Дыгало)

Соли лития – известные психотропные средства из группы нормотимиков,  активно применяемые в психиатрической практике для терапии маниакального синдрома у взрослых пациентов. В настоящее время обсуждаются перспективы их применения в перинатологии в качестве нейропротективных средств, уменьшающих степень поражения развивающегося мозга гипоксическим инсультом и токсическими агентами. Однако оказалось, что соли лития могут быть высокотоксичными для формирующегося организма в период, когда выделительная система еще не достигла функциональной зрелости,  даже в относительно невысоких дозах.  Терапевтические дозы нейролептика хлорида лития способны ослабить негативные эффекты глюкокортикоидов на экспрессию генов выживания клеток гиппокампа (Рис. 1), а также на поведении новорожденных животных.

Рис.1. Уровни мРНК антиапоптозного белка Bcl-XL в гиппокампе 3-дневных крысят через 2 ч после введения им физиологического раствора (белый столбик), дексаметазона (DEX) или хлорида лития (LiCl), а также  совместно DEX+LiCl. * p<0.05 по сравнению с физиологическим раствором.


Проект ФНМ-9. Создание клеточных моделей болезней, вызываемых экспансией тринуклеотидных повторов, с применением новейших технологий геномной инженерии (д.б.н. С.М. Закиян)

Для создания клеточной модели болезней экспансии тринуклеотидных повторов на основе эмбриональных стволовых клеток человека линии HUES9 была произведена сборка плазмидных конструкций, экспрессирующих компоненты системы CRISPR-Cas9, способных направленно вносить одно- и двуцепочечные разрывы в гены НТТ и FMR1. Кроме того, созданы донорные последовательности ДНК, FMR1_90rep и HTT_215rep, содержащие, соответственно, 90 и 215 тринуклеотидных повторов, фланкированные протяженными плечами гомологии. Функциональность сознанной системы для направленного внесения мутаций экспансии тринуклеотидных повторов подтверждена на клетках линии НЕК293Т. Получены мутантные клоны НЕК293Т, несущие до 215 тринуклеотидных повторов в гене НТТ. 

 

Рисунок. Создание молекулярных инструментов для внесения мутаций в ген НТТ человека. А. Схема создания донорной конструкции, несущей блок из 215 тринуклеотидных повторов, фланкированный плечами гомологии к гену НТТ, методом Golden Gate клонирования. Б. Проверка активности CRISPR-Cas9-нуклеаз и никаз в культуре клеток человека линии НЕК293Т гетеродуплексным анализом с использованием эндонуклеазы I фага T7. В. ПЦР-анализ клонов НЕК293Т с внесенными мутациями в первый экзон гена НТТ.

 

Проект ФНМ-11. Ренин-ангиотензиновая система мозга – центральное звено регуляции водно-солевого гомеостаза и артериального давления: экспериментальное исследование на модели стресс-чувствительной артериальной гипертонии (акад. Л.Н. Иванова)

Показано, что в гипоталамусе и продолговатом мозге молодых крыс НИСАГ повышена активность генов РАС, что выражается в росте экспрессии гена Agt и дисбалансе экспрессии генов ангиотензиновых рецепторов: в гипоталамусе повышен уровень экспрессии Agtr2, а в продолговатом мозге – Agtr1a. В гипоталамусе снижен уровень экспрессии Асе2. Водная депривация снижала уровень экспрессии Ren в гипоталамусе у крыс WAG, но не НИСАГ.

Отмеченные изменения экспрессии генов ренин-ангиотензиновой системы в головном мозге крыс НИСАГ на ранней стадии развития артериальной гипертонии можно рассматривать в качестве пускового механизма патогенеза стресс-зависимой артериальной гипертонии.

 

Рисунок. Различия экспрессии мРНК ключевых генов ренин-ангиотензиновой системы в гипоталамусе молодых гипертензивных крыс НИСАГ  по сравнению с нормотензивными крысами WAG.


ПроектФНМ-14. mTOR-сигнальный путь – новая мишень воздействий,  направленных на профилактику возрастзависимых нейродегенеративных заболеваний (д.б.н. Н.Г. Колосова)

Основная цель настоящего этапа исследований - оценка лечебного потенциала рапамицина – его способности влиять на уже выраженные нейродегенеративные изменения в мозге и сетчатке. Оценку проводили на крысах OXYS, которые с возраста 12,5 месяцев после офтальмологического осмотра  и исследования поведенческих признаков ускоренного старения мозга получали рапамицин (Tartis, Inc., Buffalo, NY) в дозах 0,1, 0,3 и 0,9 мг на кг массы тела три раза в неделю в течение 3,5 месяцев.

Ранее мы уже показали, что рапамицин способен предупреждать развитие у крыс OXYS ретинопатии, аналогичной возрастной макулярной дегенерации (ВМД) у людей,  - нейродегенеративного заболевания, которое становится основной причиной потери зрения людьми старшего возраста в развитых странах (Kolosova et al., 2012). На основании результатов настоящего исследования можно заключить, что рапамицин способен предупреждать и задерживать прогрессию ретинопатии у крыс OXYS с уже выраженными патологическими изменениями сетчатки. Результаты сравнения клинической картины  до и после приёма препарата свидетельствуют о наличии у препарата терапевтического потенциала  в отношении ВМД. В то же время результаты морфологического исследования сетчатки оказались не столь однозначными.  С одной стороны, они показали, что рапамицин проявил выраженный гемореологический эффект в отношении хориоретинальных сосудов, протективный эффект в отношении нейросенсорных клеток сетчатки и глии. Но при этом отсутствовала выраженная зависимость эффектов от дозы препарата. Вероятно, именно поэтому результаты морфологического исследования сетчатки и клинической оценки состояния глазного дна животных, полученной на основании офтальмоскопического обследования, не совпадают. При оценке состояния ганглионарных нейронов на фоне приёма рапамицина выявлено ограничение хроматолитических процессов и некротических изменений. Однако при увеличении дозы рапамицина до 0,9 мг/кг, его терапевтический эффект в отношении ганглионарных нейронов нивелировался, что несомненно, необходимо учитывать при создании лекарственной формы препарата для профилактики и лечения нейродегерптивных изменений сетчатки. Также неоднозначным оказался и оценивавшийся по поведению животных эффект рапамицина на ЦНС крыс OXYS с выраженными признаками ускоренного старения мозга. Существенного влияния препарата на поведение не выявлено, тем не менее рапамицин в дозах 0,3 и 0,9 мг на кг массы тела в определенной степени повысил эффективность обучения крыс OXYS условной реакции пассивного избегания.

С одной стороны, на первом этапе работы (отчет за 2013 г., статья Kolosova et al., 2013) нами выявлен мощный профилактический потенциал рапамицина в отношении связанных с возрастом изменений поведения, его способность предупреждать развитие у крыс OXYS нейродегенративных изменений мозга, которые были зарегистрированы нами методами МРТ.  С другой стороны, лечебный эффект – влияние рапамицина на уже выраженные фенотипические (поведенческие) проявления ускоренного старения мозга крыс OXYS, оказался незначительным. 

В целом рапамицин перспективен как средство профилактики ускоренного старения мозга и терапии возрастной макулярной дегенерации, эффективных способов лечения которой на сегодня не существует. Однако, как показали наши исследования, его эффекты зависят не только от дозы, но и от генотипа животных (отчет за 2013 г.): было показано, что рапамицин дозах, замедливших ускоренное старения мозга (Kolosova et al., 2013) и развитие ретиинопатии у  крыс OXYS, существенно повысил тревожность крыс Вистар.  Полученные результаты свидетельствуют о необходимости проведения дополнительных исследований с целью подбора оптимальных режимов применения и отработки эффективной и безопасной терапевтической дозы препарата. 

 

Проект ФНМ-16. Взаимосвязь иммунных и метаболических нарушений в структуре психоэмоциональных расстройств: разработка инновационных подходов к лечению иммунодефицитных состояний (д.б.н. Н.Н. Кудрявцева.

У самцов мышей с повторным опытом агрессии не было найдено изменений в весовых характеристиках и общем количестве клеток в тимусе, селезенке по сравнению с контролем. В то же время у них изменялся субпопуляционный состав клеток селезенки: снижался процент В-клеток CD19+ и лимфоцитов CD16/32+, а также популяций Т-лимфоцитов – CD4+8-, CD4-8+, и CD4+25hi+, при повышении процента активированных клеток CD4-25+. В тимусе у агрессивных самцов было обнаружено снижение процента клеток CD4-25+. При этом снижался процент спленоцитов в фазе апоптоза (A0) и покоя (G0/G1), и повышался процент пролиферирующих клеток (S+G2/M). Процент тимоцитов в фазе A0 повышался и процент в фазе S+G2/M снижался. Активность лактатдегидрогеназы в лимфоцитах крови существенно снижалась. Данные дают основание предполагать повышение риска развития аутоиммунных процессов под влиянием повторного опыта агрессии.

В целях поиска препаратов, которые бы одновременно улучшали психоэмоциональное состояние и стимулировали иммунитет был выбран хлорид лития. Было показано, что при превентивном введении литий оказывает выраженный анксиогенный эффект, а при лечебном введении – анксиолитический эффект. Сходный анксиолитический эффект наблюдался и у интактных самцов. Не было выявлено влияние хлорида лития на агрессивность. 

 

 

Рисунок 1. Экспрессия гена Ptpn5 в структурах головного мозга каталептической рекомбинантной линии B6.CBA-D13Mit76 (B6-D13) и некаталептической реципиентной линии C57BL/6 (B6). ***p<0.001 vs B6.


Проект ФНМ-23. Полногеномный поиск SNPs, способствующих возникновению активирующих мутаций, для формирования новой группы маркеров предрасположенности к канцерогенезу (д.б.н. Т.И. Меркулова)

Проанализированы результаты более 600 полногеномных исследований (выявление мест связывания транскрипционных факторов и  гистоновых меток методом ChIP-seq,  определение транскриптомов) выполненных  для 23 различных клинических образцов рака толстого кишечника и клеточных линий, полученных из таких образцов и обнаружены 12 новых регуляторных SNP, связанных с возникновением колоректального рака. Изучены 3 SNPs; rs12228277: T>A, rs12226937: G>A, and rs61761074: T>G) в интроне 2 гена K-RAS человека, который является одним из основных кандидатных генов развития рака толстого кишечника, рака легких и рака поджелудочной железы. Методом EMSA показано, что rs12228277 и  rs61761074 демонстрируют различные картины связывания ядерных белков клеток легких с олигонуклеотидными пробами, соответствующими альтернативным аллелям. Оказалось, что в обоих случаях изменения затрагивают сайт связывания транскрипционного фактора NF-Y. Как  rs12228277, так и    rs61761074 проявляли также функциональную активность при присоединении к промоторному району репортерного гена люциферазы. Для одного из SNPs (rs61761074) показана статистически значимая связь минорного аллеля с предрасположенностью к немелкоклеточному раку легких (p<0,05). Результаты проведенного исследования показывают, что замена  T>G в позиции  615 второго интрона гена K-ras (rs61761074) представляет собой важный фактор риска развития немелкоклеточного рака легких. 

 

Проект ФНМ-28. Фундаментальные эпидемиологические аспекты потенциальной мужской фертильности: значение для профилактической медицины и демографии (к.б.н. А.В. Осадчук)

Структурный анализ хроматина сперматозоидов методом SCSA (sperm chromatin structure assay) с использованием проточной цитометрии выявил достоверные корреляции индекса фрагментации ДНК (ИФД) со всеми показателями спермограммы (Рис.). Также было продемонстрировано, возрастание ИФД мужчин-добровольцев, у которых обнаружена олигоспермия или аспеноспермия. 

 

 

Рисунок.  Взаимосвязь индекса фрагментации ДНК с показателями спермограммы, с наличием олигоспермии, астеноспермии и избыточного веса тела.

Интересно отметить, что ИФД достоверно увеличен у мужчин с избыточным весом. У них же обнаружено снижение сперматогенеза, гормона клеток Сертоли семенников – ингибина В, а также компенсаторное возрастание уровней гонадотропных гормонов. Таким образом, избыточный вес тела снижает не только репродуктивный потенциал, но и приводит к нарушению упаковки хроматина и разрывов ДНК в сперматозоидах.

 

Проект ФНМ-29. Диагностика адаптивного потенциала человека: молекулярно-генетические и иммуногенетические механизмы адаптации к Северу у коренных этносов в сравнении с русскими жителями Сибири (к.б.н. Л.П. Осипова)

Система биотрансформации ксенобиотиков (СБК) играет ключевую роль в защите организма от множества вредных экзогенных веществ. Среди главнейших представителей СБК выделяются семейства цитохромов Р450 (CYP) и глутатион-S-трансфераз (GSTs). По данным многих исследователей, функциональные замены в генах этих семейств ферментов ассоциированы с повышенным риском онкологических и других мультифакториальных заболеваний. В предыдущем отчётном году нами было изучено распределение генотипов полиморфных локусов A1405G (замена Ile105Val) и C2285T (замена Ala114Val) в гене GSTP1, а также локуса A2455G (замена 462Val) в гене CYP1A1 в популяции тундровых ненцев, проживающих в Ямало-Ненецком автономном округе.

В 2014 г. была сформирована выборка из 274 русских, проживающих в Ямало-Ненецком автономном округе. Из образцов крови была выделена ДНК методом фенол-хлороформной экстракции. В образцах ДНК методом ПЦР в реальном времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов были определены генотипы по полиморфным однонуклеотидным локусам A1405G (замена Ile105Val) и C2285T (замена Ala114Val) в гене GSTP1, а также генотипы по полиморфному локусу A2455G в гене CYP1A1. Результаты генотипирования и сравнения с выборкой тундровых ненцев приведены в таблицах 1-3.

Таблица 1. Частоты генотипов и аллелей полиморфного локуса A1405G (Ile105Val) гена GSTP1 среди тундровых ненцев и русских Сибири.

 

Встречаемость (частота) генотипов

GSTP1 A1405G (Ile105Val)

Частота аллеля 105Val

Сравнение выборок (p-value)

 

Ile/Ile

Ile/Val

Val/Val

Ненцы

(N=287)

164 (57.1%)

110 (38.3%)

13 (4.5%)

23.7%

χ2=19.04; p<0.001

Русские

(N=274)

113 (41.2%)

126 (46.0%)

35 (12.8%)

35.8%

Таблица 2. Частоты генотипов и аллелей полиморфного локуса C2285T (Ala114Val) гена GSTP1 среди тундровых ненцев и русских Сибири.

 

Встречаемость (частота) генотипов

GSTP1 C2285T (Ala114Val)

Частота аллеля 114Val

Сравнение выборок (p-value)

 

Ala/Ala

Ala/Val

Val/Val

Ненцы

(N=259)

236 (91.1%)

21 (8.1%)

2 (0.8%)

4.8%

χ2=6.95; p<0.01

Русские

(N=261)

215 (82.4%)

44 (16.9%)

2 (0.8%)

9.2%

Таблица 3. Частоты генотипов и аллелей полиморфного локуса A2455G (Ile462Val) гена CYP1A1 среди тундровых ненцев и русских Сибири.

 

Встречаемость (частота) генотипов

CYP1A1 A2455G (Ile462Val)

Частота аллеля 462Val

Сравнение выборок (p-value)

 

Ile/Ile

Ile/Val

Val/Val

Ненцы

(N=271)

163 (60.2%)

87 (32.1%)

21 (7.8%)

23.8%

χ2=68.2; p<0.001

Русские

(N=261)

240 (89.9%)

23 (8.6%)

4 (1.5%)

5.8%

Распределение частот генотипов во всех случаях соответствует равновесию Харди-Вайнберга. Частоты аллелей в выборке русских Севера соответствуют частотам, характерным для европеоидных популяций (по данным проекта 1000Genomes). Выборки тундровых ненцев и русских Северной Сибири различаются между собой по частоте аллелей исследованных полиморфных локусов.

 

Проект ФНМ-30. Комплексное изучение наследуемых форм потери слуха в популяциях Сибири (к.б.н. О.Л. Посух)

Получена сравнительная оценка доли генетической компоненты, определяемой мутациями гена GJB2 (Сх26), в этиологии потери слуха у населения Республик Алтай и Тыва. Мутационный спектр гена GJB2 имеет этническую специфичность и характеризуется наличием мажорных для коренного населения изучаемых регионов мутаций этого гена, распространенность которых, вероятно, определяется эффектами основателя. Суммарная частота гетерозиготного носительства рецессивных мутаций гена GJB2 у тувинцев - 11.57% (p.W172C - 4.96%, c.IVS1+1G>A – 4.13%, p.V37I – 2.48%); у алтайцев - 4.54% (c.235delC – 3.64%, p.W172C – 0.45%, p.M34T - 0.45%). Полученные результаты актуальны для разработки оптимальной для этих регионов Сибири молекулярной диагностики наследуемой потери слуха и медико-генетического консультирования отягощенных семей.

Рисунок 1. Доля пациентов с потерей слуха, обусловленной мутациями гена GJB2 (Cx26), и мутационный спектр GJB2 в этнически стратифицированных выборках пациентов (алтайцы, тувинцы, русские, казахи, метисы) (А). Распределение мажорных GJB2-мутаций p.W172C, IVS1+1G>A и c.235delC (получено на основе данных о месте рождения, в отдельных случаях - месте проживания, всех индивидуумов, имеющих данные мутации: больные, их родственники и гетерозиготные носители этих мутаций из контрольных выборок алтайцев и тувинцев) на территории Республик Алтай и Тыва (Б).

 

Проект ФНМ-32. Высокоразрешающая диагностика структурных хромосомных аномалий человека (д.б.н. Н.Б. Рубцов)

В 2013 году были получены микродиссекционные ДНК библиотеки из малой сверхчисленной маркерной хромосомы и q-плеча хромосомы 15 человека. Для контроля качества полученной микродиссекционной ДНК-библиотеки и первичного определения состава малой сверхчисленной маркерной хромосомы в дополнительных циклах ПЦР в присутствии Alexa488-dNTP в 2014 году была получена ДНК-проба и проведена супрессионная гибридизация in situ с метафазными хромосомами пациента. Анализ сигнала флуоресцентной гибридизации in situ и инвертированного DAPI-бэндинга позволили описать аномальную хромосому как inv dup(15)(q13). В качестве контрольного образца аналогичным образом была создана микродиссекционная ДНК-библиотека хромосомы 15 человека, и проведен контроль ее качества.

ДНК микродиссекционных ДНК-библиотек была фрагментирована и конвертирована в ДНК-библиотеки со средним размером встройки 100 п.н. для последующего массового параллельного секвенирования на секвенаторе Ion Torrent, согласно стандартному протоколу. Каждая из двух библиотек была секвенирована на Ion Torrent PGM с использованием одного чипа 314 при чтении 100 п.н. В результате биоинформатического анализа секвенированных последовательностей были выявлены как последовательности гомологичные последовательностям генома человека, так фрвнменты ДНК, негомологичные ДНК человека. Последние могут представлять собой как амплифицированные фрагменты ДНК, соответствующие ДНК, контаминирующей ферменты, используемые при обработке диссектированного материала и в низкотемпературных циклах ПЦР с частично вырожденным праймером, так и ПЦР-артефактную ДНК, формирующуюся в низкотемпературных циклах ПЦР с частично вырожденным праймером в результате частичного отжига олигонуклеотидов.

Эти последовательности были исключены из последующего биоинформатического анализа. Для исключения из анализа диспергированных повторенных последовательностей, из рассмотрения были также исключены последовательности, гомологичные ДНК хромосомы 1 человека. Такой подход позволил очистить полученные базы данных секвенированных последовательностей микродиссекционных ДНК-библиотек хромосомы 15 человека и анализируемой малой сверхчисленной маркерной хромосомы от значительной части диспергированных повторенных последовательностей. Для остальных севенированных последовательностей микродиссекционных ДНК-библиотек была определена их локализация в хромосоме 15. Для оценки распределения ДНК микродиссекционных ДНК-библиотек последовательность нуклеотидов хромосомы 15 была разделена на участки размером 50 тыс. пар оснований, и для каждого участка было определено число ридов. Проведенный анализ показал, что разрыв и воссоединение районов хромосомы 15 при формировании малой сверхчисленной маркерной хромосомы имело место в суббэнде 15q13.3. Особенности ДНК горячей точки хромосомных перестроек обусловили локализацию точки разрыва с точностью до соответствующего ей района. Было показано, что разрыв исходной хромосомы имел место в районе поз. chr15:32,465,149-32,925,701. Т.е., проведен биоинформатический анализ последовательностей первичной ДНК-библиотеки маркерной хромосомы и ДНК-библиотеки q-плеча хромосомы 15. Его результаты показали, что глубины покрытия, обеспечиваемого секвенированием даже на одном 314 чипе, достаточно для существенного (на порядок) улучшения точности локализации хромосомных перестроек по сравнению с FISH. Реализация этого подхода позволит в 4-5 раз повысить уровень разрешения в локализации точки разрыва, имевшего место при возникновении анализируемой inv dup(15)(q13).

 

Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН А.II.6 «Молекулярная и клеточная биология» (координатор – акад. Г.П. Георгиев)

Проект 6.6. Системная биология: экспериментально-компьютерное исследование регуляции экспрессии генов про- и эукариот (акад. Н.А. Колчанов)

Проведен анализ результатов компьютерного моделирования РНК-связывающих белков Nip7 глубоководных и мелководных архей. Статистический анализ позволил выявить позиции белка, в которых наблюдаются статистически значимые различия в конформационных изменениях полипептидной цепи а также ее флуктуациях для этих двух белков, возникающие при высоких температурах и давлениях. Часть выявленных позиций находятся в участках белка, для которых было предсказано участие в белок-белковых взаимодействиях белка Nip7 с возможным партнером - белком экзосомального комплекса.

А). Значения среднеквадратичных локальных отклонений (RMSDL) для моделей белков Nip7 :  NIP7-ABY (глубоководный организм) и NIP7-FUR (мелководный организм) усредненные по всем траекториям. Красные треугольники показывают позиции, в которых параметр RMSDL значимо зависит от типа белков.

Б). Значения среднеквадратичных флуктуаций (RMSF) для моделей белков Nip7 :  NIP7-ABY (глубоководный организм) и NIP7-FUR (мелководный организм) усредненные по всем траекториям. Красные треугольники показывают позиции, в которых параметр RMSDL значимо зависит от типа белков.

 

Проект 6.7. Серотониновые рецепторы мозга в молекулярно-генетических механизмах патологического поведения: взаимодействие с дофаминовой системой (д.м.н.  Н.К. Попова)

Тридцатидневный космический полет вызывал существенное снижение экспрессии гена, кодирующего ключевой фермент биосинтеза дофамина – тирозингидроксилазу в черной субстанции. Космический полет привел также к снижению в полосатом теле экспрессии гена, кодирующего один из ферментов катаболизма дофамина – катехол-О-метилтрансферазу. Кроме того, экспрессия гена D1 рецептора в гипоталамусе и полосатом теле была снижена у мышей, подвергавшихся длительному космическому полету, по сравнению с мышами контрольной группы.

 

Рисунок 1. Эффект длительного космического полета на экспрессию генов, кодирующих D1 (A), D2 (Б) рецепторы, катехол-О-метилтрансферазу (COMT) (В) и дофаминовый транспортер (DAT) (Г) в мозге мышей. FC – форонтальная кора; VC – визуальная кора; MB – средний мозг; HC – гиппокамп; HT – гипоталамус; ST – стриатум; SN – черная субстанция. * p<0.05 по сравнению с контролем.

 

Проект 6.14. Особенности организации и регуляции экспрессии гомеологичных генов, определяющих развитие пшеницы (д.б.н. Е.А. Салина)

Впервые было проведено частичное 454-пиросеквенирование длинного и короткого плеча хромосомы 5B (8 и 6% общей длины плеч 5BL и 5BS, соответственно). Проведена количественная оценка распределения семейств повторяющихся последовательностей для обоих плеч хромосомы 5В. Показано, что мобильные элементы представлены в основном ретротранспозонами и составляют порядка 70% проанализированных нуклеотидных последовательностей. Сравнивая прочтения хромосомы 5B мягкой пшеницы с аналогичными данными по хромосоме 5A, было показано, что в последовательностях хромосомы 5B преобладают ретротранспозоны семейств Fatima и Sakura, а также семейство ДНК-транспозонов Jorge.

Оценка кодирующих последовательностей ДНК показала, что содержание гипотетических генов составляет порядка 2.0% короткого и 2.07% длинного плеч хромосомы. Используя методы картирования in silico, были идентифицированы районы синтении с хромосомами риса и Brachypodium, суммарно составляющие 1,073,526 и 1,767,298 п.н., соответственно. На рисунке представлены участки синтении между плечами хромосомы 5В и хромосомами риса и Brachypodium в цветовой гамме. 

Рисунок 1. Нуклеотидные последовательности прочтений хромосомы 5B мягкой пшеницы картированы на геномы Brachypodium и риса. Для идентификации районов синтении между хромосомами Brachypodium, риса и хромосомы 5В, геномные последовательности ДНК данных видов были условно разделены на участки размером 400 т.п.н., для каждого из которых было рассчитано содержание последовательностей, показавших существенное сходство с 454-прочтениями хромосомы 5B, полученными в данной работе (представлено в виде параметра cover_1, значения которого отражены на рисунке в виде цветовой шкалы). Цветовая шкала является специфичной для каждого генома, и, таким образом, прямое сравнение выравниваний между разными геномами не является возможным.

 

Проект 6.17. Молекулярно-генетические механизмы прямых и коррелированных ответов на отбор по поведению и стресс-реактивности: экспериментальное исследование на моделях доместикации и крысах линий НИСАГ, ГК и МД (д.б.н. А.Л. Маркель)

Развитие стресс-зависимой гипертензии у крыс НИСАГ связано с изменением генетического контроля иммуногенной функции селезенки. Признак - «относительный вес селезенки» может рассматриваться как вспомогательный для определения генов кандидатов, контролирующих уровень артериального давления у крыс НИСАГ в покое и при стрессе. Впервые установлены 4 вероятных (suggestive) локуса для признака «абсолютный  вес селезенки», а также 5 вероятных локусов и один высоко достоверный - в дистальной части хромосомы 1 для признака «относительный вес селезенки» (Рис. ). Достоверный локус на хромосоме 1 является общим для признаков «относительный вес селезенки», «уровень артериального давления в покое» и «уровень артериального давления при стрессе». Предполагается, что селезенка при стресс-зависимой гипертонии выполняет роль переключателя, который контролирует количество периферических нейроэндокринно-иммунных медиаторов в крови и поддерживает тесную связь с центральным ответом на стресс через регуляцию симпатической иннервации почки (splenorenal reflex). Считается также, что селезенка сама может быть источником вазоактивных факторов.

Рисунок. Сравнение графиков распределения вероятностей сцепления для признака “относительный вес селезенки” и признаков «артериальное давление в покое» и «артериальное давление при стрессе» у крыс самцов-гибридов F2 (НИСАГ × WAG) в возрасте шести месяцев на хромосоме 1.

 

Проект 6.18. Влияние структуры 5′-нетранслируемого района на эффективность трансляции эукариотических мРНК в норме и в условиях стресса (к.б.н. А.В. Кочетов)

Разработан алгоритм поиска альтернативных сайтов инициации трансляции в мРНК генов млекопитающих, позволяющий предсказывать потенциальные открытые рамки считывания, транслируемые с высокой вероятностью.


Проект 6.19. Молекулярные и эпигенетические механизмы процесса инактивации Х-хромосомы и репрограммирования соматических клеток к плюрипотентному состоянию  (д.б.н. С.М. Закиян)

Впервые проведено секвенирование и сравнительный анализ транскриптомов плюрипотентных клеток крысы (ЭСК и ИПСК), а также эмбриональных фибробластов (REF). Массовое параллельное секвенирование мРНК (RNA-Seq) с использованием платформы Illumina GAIIx было выполнено для двух линий фибробластов (RNFF1, RNFM1), двух линий ЭСК (RES27, dB50) и четырех линий ИПСК. Используя данные RNA-seq, был проведен кластерный анализ транскриптомов исследуемых клеточных линий (Рисунок A). Показано, что линии ИПСК и ЭСК образуют единый кластер и показывают высокое сходство паттерна экспрессии генов (минимальный коэффициент корреляции – 0,86). При этом корреляция между профилями экспрессии линий riPSCs - QV8 и rESCs - dB50 составляет 0,96, свидетельствуя, что эмбриональные фибробласты крысы в процессе репрограммирования достигли плюрипотентного состояния, практически неотличимого от ЭСК. При этом линии RES27 (rESCs) и NF21 (riPSCs) имеют наименьшее сходство среди плюрипотентных клеток (коэффициент корреляции 0,84), соответственно, что говорит о существовании вариабельности между экспрессионными профилями в плюрипотентных клетках. По всей видимости, такая вариация является свойством клеточных линий и не связана с процессом репрограммирования. Две линии фибробластов имеют значительное сходство по профилю экспрессии генов между собой (коэффициент корреляции 0,89), формируя отдельный кластер, но значительно отличаются от плюрипотентных клеток (максимальный коэффициент корреляции 0,34). Для исследуемых клеточных линий крысы была построена heat map спектра генов, вовлеченных в поддержание процессов самообновления и плюрипотентности у мыши и человека (Рисунок Б). Результаты наглядно демонстрируют высокий уровень транскрипции маркеров плюрипотентности и сходство внутри выборки ЭСК и ИПСК, а также низкий уровень транскрипции генов плюрипотентности и сходство внутри выборки фибробластов.

Рисунок. Сравнительный анализ транскриптомов фибробластов (RNFF1, RNFM1), эмбриональных стволовых клеток (QV8, SU3, NF13, NF21) крысы. A) Иерархический кластерный анализ транскриптомов. (Б) Тепловая карта уровня экспрессии основных генов плюрипотентности.


Проект 6.20. Анализ функции белков семейства Bcl-2, защищающих клетки мозга от гибели, в механизмах устойчивости к индуцируемой стрессом психопатологии (чл.-корр. РАН Н.Н. Дыгало)

Глюкокортикоидные гормоны способствуют преодолению неблагоприятных эффектов стресса, но их высокие уровни вызывают депрессивные расстройства. Двойственность эффектов, делает  роль глюкокортикоидой сигнализации в развитии первых эпизодов стресс-индуцированной депрессии неясной. С целью выяснения этого вопроса, исследовали эффекты  модуляции глюкокортикоидного сигнала на депрессивно-подобный тип поведения в претестовой (первой) и тестовой (повторной) сессии теста вынужденного плавания.

Обнаружено, что эффект глюкокортикоидов изменяется с продепрессантного при первом стрессировани на антидепрессантный  при повторном стрессе, и это изменение гормонального эффекта ассоциировано с повышением экспрессии рецепторов глюкокортикоидов в префронтальной коре (Рис.1). 

Рисунок 1. Эффект стресса вынужденного плавания на экспрессию GR (красное иммуногистохомическое окрашивание) в префронтальной коре крыс, получавших растворитель (VEH), метопирон (МЕТ) или MET + дексаметазон (DEX).

а. GR-иммунореактивность представленная как процент от уровня  группы VEH (принятого за 100%). В базальных условиях (CONTROL) и через 2 часа после повторного стресса вынужденного плавания (FS STRESS). Данные представлены в виде средних ±  SEM. * р <0,05 по сравнению с обоими VEH CONTROL и VEH FS STRESS группами.

б. Типичные изображения окрашивания GR в префронтальной коре через 2 ч после второго FS стресса у VEH и МЕТ + DEX-крыс. На вставках показаны увеличенные изображения выделенных квадратами участков препаратов мозга. Масштабная линейка = 50 мкм.

 

Проект 6.22. Генетический полиморфизм ферментов системы свертывания крови у тундровых ненцев и их метисов в связи с типом питания и проживанием в условиях Севера с целью выработки подходов к диагностике тромбозо-зависимых заболеваний. (к.б.н. Л.П. Осипова)

В 2014 г. с помощью анализа родословных была сформирована выборка лесных ненцев (208 человек), проживающих в близких с тундровыми ненцами условиях и придерживающихся сходного «полярного» типа питания. Также была сформирована выборка метисов 1-го поколения от смешения коренного населения с пришлым европеоидным (177 человек), проживающих в условиях севера (Ямало-Ненецкий АО). Из образцов крови была выделена ДНК методом фенол-хлороформной экстракции. В образцах ДНК методом ПЦР в реальном времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов были определены генотипы по полиморфным однонуклеотидным локусам G20210A гена F2 (фактор свёртывания FII – протромбин) и G1691A (мутация Лейден) в гене F5 (фактор свёртывания FV). В изученной выборке лесных ненцев не было найдено ни одного минорного аллеля (20210A или 1691A) данных полиморфных локусов. Сравнение выборки лесных ненцев с тундровыми ненцами и русскими, проживающими на той же территории, приведено в таблице 1. Данные по метисам находятся в стадии обработки.

Таблица 1. Частоты минорных аллелей полиморфных локусов G20210A гена F2 (rs1799963) и 1691A гена F5 (rs6025) среди лесных ненцев, тундровых ненцев и русских Сибири.

 

N

Частота аллеля F2 20210A

Частота аллеля F5 1691A

Сравнение с выборкой русских (p-value)

Лесные ненцы

208

0%

0%

0.003

Тундровые ненцы

266

0%

0.4%

0.010

Русские

304

0.7%

2.5%

-

 

 

 

 

Низкая частота мутаций G20210A и G1691A среди ненцев указывает на слабый популяционный риск развития тромбозов и связанных с ними осложнений, причинами которых может быть носительство данных мутантных вариантов.

 

Проект 6.24. Функциональные особенности дуплицированных копий генов у злаковых растений (д.б.н. Е.К. Хлёсткина)

Проведено выделение и сравнительный анализ организации ортологичных копий гена, кодирующего халконфлаванонизомеразу (CHI), у различных видов трибы Пшеницевые. Установлено, что у злаковых растений, относящихся к данной трибе, в гене CHI дважды происходила элиминация интронов (рис. 1а), что может быть связано с оптимизацией времени, затрачиваемого на транскрипцию и процессинг генов, участвующих в адаптации организмов к экстремальным условиям внешней среды. Показано, что три дуплицированные копии гена CHI мягкой пшеницы существенно дивергировали в регуляторных областях и проявляют различный уровень экспрессионной активности, в том числе, в ответ на стресс. Установлено, что изменение суммарного уровня мРНК CHI при замещении одной из дуплицированных копий гена CHI мягкой пшеницы чужеродными генами-ортологами носит тканеспецифичный характер (рис. 1б).

Рисунок 1. А: Элиминация интронов в ходе эволюции генов злаков, кодирующих халконфлаванонизомеразу. Б: Относительный уровень суммарной мРНК гена CHI в корнях и колеоптиле сортов (S29 – Саратовская 29, Rod - Родина) и интрогрессивных линий (S29-Tt5G и Rod-Aes5S) пшеницы.

 

Проект 6.25. Молекулярные механизмы формирования психоэмоциональных расстройств (д.б.н. Н.Н. Кудрявцева)

Повторный опыт агрессии сопровождается развитием психопатологии агрессивного поведения у самцов мышей, при которой происходит изменение активности многих нейромедиаторных систем мозга на уровне метаболизма, рецепции и экспрессии генов. Показано, что у самцов мышей с повторным опытом агрессии происходит увеличение числа  BrdU+ клеток в субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампа, что свидетельствует об увеличении процессов пролиферации клеток в этой зоне. После прекращения конфронтаций в течение 14 дней, число клеток все еще остается повышенным.  В то же время нейрональная активность, оцениваемая по числу C-fos+  клеток, увеличивается после 10 дней агрессии, впоследствии снижаясь до уровня контроля после 20 дней. После периода депривации число C-fos+ клеток становится существенно ниже по сравнению со всеми группами исследованных животных. Работа выполнена совместно с группой Нейральных стволовых клеток (Рук. проф. Г.Н. Ениколопов, Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, USA). 

 

Рисунок 1. Число BrdU+ и c-fos+ клеток в субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампа у контрольных животных и у самцов с повторным опытом агрессии в течение 10 и 20 дней (А10 и А20), а также после 2 недель депривации (А20-Д) - прекращения конфронтаций.  * - P < 0.05; vs  контроль; # - P < 0.05; ## - P < 0.01 vs А10; + - P < 0.05 vs А20.

 

Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Живая природа: современное состояние и проблемы развития» (координатор – акад.
Д.С. Павлов)

Подпрограмма 1: Биоразнообразие: состояние и динамика (координатор чл.-корр. РАН В.П. Седельников)

Проект 30.1. Сохранение биоразнообразия млекопитающих путем создания криобанка эмбрионов и межвидовой эмбриотрансплантации на примере хомячков рода Phodopus (д.б.н. С.Я. Амстиславский)

Показано существенное улучшения  результатов культивирования in vitro эмбрионов хомячков Кэмпбелла и джунгарского путем воздействия на них гранулоцитарного-макрофагального колониестимулирующего фактора. Продемонстрирована возможность преодоления межвидового репродуктивного барьера путем трансплантации эмбрионов как хомячка Кэмпбелла, так и джунгарского реципиентам – межвидовым гибридам.

Таблица 1. Результаты культивирования in vitro эмбрионов джунгарских хомячков (Phodopus sungorus) в течение 48 часов, начиная с ранних стадий дробления 

 

Группы

Число

Число

Из них развилось в течение

48 часов культивирования

 

      замороженных

эмбрионов

выживщих

эмбрионов (%)

Морул (%)

Бластоцист (%)

R1ECM («свежие»)

9 (100)

6 (66,7)

0 (0)

R1ECM («крио)

29

17 (58,6)

11 (64,7)

0 (0)

R1ECM («крио)+ GM-CSF

12

8 (66,7)

4 (50)

4 (50)*

R1ECM («крио) + EGF

16

11 (68,8)

7 (63,6)

1 (9,1)

 

Примечания:

*, различия достоверны по отношению к двум контрольным группам культивировавшихся без факторов P < 0.05

Расшифровка по группам:

R1ECM («свежие»): Эмбрионы джунгарского хомячка не подвергали замораживанию,

а культивировали в R1ECM минуя этап замораживания

R1ECM («крио): То же что предыдущая группа, но эмбрионы перед культивированием подвергали замораживанию и криоконсервации

R1ECM («крио)+ GM-CSF: То же что и «R1ECM («крио)», но в среду культивирования был добавлен гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) в дозе 2 нг/мл

R1ECM («крио) + EGF : То же что и «R1ECM («крио)», но в среду культивирования был добавлен эпидермальный ростовой фактор (EGF) в дозе 10 нг/мл

 

Результат этого эксперимента на эмбрионах джунгарских хомячков дал четкие результаты. Было подтверждено, что большая часть эмбрионов этого вида успешно переживает замораживание и криоконсервацию и  такие эмбрионы способны к последующему развитию in vitro. Новым результатом было то, что в выбранной дозе гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор способен стимулировать развитие in vitro эмбрионов джунгарского хомячка, достоверно повышая образование бластоцист.

 

Подпрограмма 3. Динамика и сохранение генофондов (координатор акад. В.К. Шумный)

Проект 30.26. Разработка методов поиска ключевых генов – мишеней для селекции и трансгенеза (д.б.н. Т.И. Аксенович)

Создан пакет программ FFBSKAT  (Fast Family-Based Sequence Kernel Association Test), являющийся самой быстрой, полной и удобной реализацией метода регионального анализа ассоциаций по выборкам родственных особей. Пакет находится в свободном доступе по адресу http://mga.bionet.nsc.ru/soft/FFBSKAT/.

Время вычислений, осуществляемых нашим пакетом FFBSKAT, как минимум в 4 раза меньше, чем самым быстрым из существующих пакетов famSKAT. Такое ускорение было достигнуто за счет разработки специальных вычислительных алгоритмов и использования оптимальных библиотечных функций. Кроме того, наш метод выгодно отличается от существующих по набору опций, он не только включает в себя все опции, предусмотренные любым из существующих пакетов, но и дополнен рядом новых опций. Наш пакет FFBSKAT удобен для пользователей, особенно в случае полноэкзомного анализа ассоциаций. 

Рисунок 1. Время проведения регионального анализа ассоциаций на семейных выборках разного размера с помощью разных методов. Синий - FFBSKAT, Красный – famSKAT.


Проект 30.27. Идентификация пластидных генов, ответственных за создание репродуктивных барьеров вследствие конфликта ядра и цитоплазмы в роде горох (Pisum L.) (к.б.н. В.С. Богданова)

Определены последовательности пластидного генома линии культурного гороха и четырех линий дикого гороха. Номинированы кандидаты на роль генов несовместимости ядра и пластид, ген accD со стороны пластидного генома, кодирующий бета субъединицу карбоксилтрансферазы, входящую в состав гетеромерной формы пластидной ацетил-коА карбоксилазы, и ген bccp3 со стороны ядерного генома, кодирующий белок-переносчик биотина и карбоксила, входящий в состав того же мультимерного комплекса. Впервые представлена модель ядерно-цитоплазматической несовместимости у растений, включающая как ядерные, так и пластидные гены-кандидаты.

 

Рис. 1. Гипотетическая схема возникновения ядерно-пластидного конфликта у гороха за счет несоответствия субъединиц пластидной мультимерной ацетил-коА карбоксилазы.

 

Белым цветом показаны субъединицы, кодируемые в ядре:
BC – биотинкарбоксилаза (от англ. Biotin carboxylase)
a-CT – альфа субъединица карбоксилтрансферазы (от англ. Carboxyltransferase)
BCCP – белок-носитель биотина и карбоксила (от англ. Biotin Carboxyl Carrier Protein)
Серым цветом показаны субъединицы, кодируемые в пластидах:
b-CT – бета субъединица карбоксилтрансферазы (от англ. Carboxyltransferase).

 

Проект 30.29. Полиморфизм генов терморецепторов в этнических группах Сибири и Крайнего Севера (чл.-корр. РАМН М.И. Воевода)

Были проанализированны особенности структурной вариабельности гена TRPM8 по двенадцати однонуклеотидным полиморфизмам (ОНП) в популяции русских (Табл.1). Поскольку полиморфизмы R52R, A80G, E662G, G882C и rs10166942 проанализированны впервые, для каждого ОНП были подобраны праймеры и условия реакции. Изученные ОНП локализованы в последовательностях ДНК, кодирующих цитоплазматические домены канала: аминный - R52R, A80G, R247T, P249P, L250L, Y251C, S419N, E662G и карбоксильный - I1016I, V1058V, а также пятый трансмембранный сегмент - G882C. ОНП rs10166942 локализован в 5’- фланкирующей области гена.  Четыре из изученных ОНП расположены в 7 экзоне гена, три (P249P, L250L, Y251C) - в чередующихся кодонах, а R247T - через кодон от Р249Р.

Таблица 1.  Характеристика ОНП гена TRPM8

В эксперименте на добровольцах, относящихся к русской этнической группе, в группе носителей гетерозиготного генотипа rs11562975, располагающегося в 6 экзоне гена, кодирующего термочувствительный ионный канал TRPM8 показаны: не только повышенный уровень ощущений к холоду, но также и гипометаболическая реакция на охлаждение кожи и на нетемпературную активацию холодочувствительного ионного канала TRPM8 ментолом – снижение газообмена, легочной вентиляции и коэффициента экстракции кислорода. Для субъектов, имеющих гомозиготный генотип GG, характерен более низкий уровень ощущений холода и адекватный ответ организма на охлаждение, с точки зрения терморегуляции (уменьшение теплоотдачи с дыханием и переход на жировой обмен). Таким образом, изменения периферической термочувствительности, определяющей функционирование эффекторных систем, например, внешнее дыхание и газообмен, могут иметь как фенотипический, так и генотипический характер.

 

Проект 30.30. Создание фен- и генколлекций тетраплоидных пшениц и их использование в селекционно-генетических исследованиях (чл.-корр. РАСХН Н.П. Гончаров)

Наличие делеций в промоторной области является причиной формирования признака «яровость» у пшениц (озимый фенотип является «диким»). Биоинформатический анализ последовательностей промоторных районов различных аллельных вариантов гена Vrn-1A показал, что делеции в случае вариантов Vrn-A1b, Vrn-A1f, Vrn-A1e и Vrn-A1dic располагаются в районах предполагаемых сайтов связывания транскрипционных факторов. Утрата данных сайтов связывания является возможной причиной изменения функции гена Vrn-A1 и перехода от озимого типа развития к яровому. Таким образом, установлено, что для 36 исследованных образцов тетраплоидных видов пшениц нарушения в промоторной области гена Vrn-A1 является причиной формирования признака «яровость». Для 16 других исследованных образцов яровость, по-видимому, не связана с вариабельностью промоторной области данного гена. На основании полученных данных участниками проекта было предложена схема эволюционного происхождения различных аллельных вариантов гена Vrn-A1. На рис. 1 схематично представлены обнаруженные аллельные варианты промоторной области гена Vrn-A1 из геномов ди-, тетра- и гексаплоидных видов пшениц, а также их предполагаемое эволюционное происхождение.

 

Рис. 1. Выявленные аллельные варианты промоторной области гена Vrn-A1, определяющего тип развития у пшениц,  из геномов ди-, тетра- и гексаплоидных видов пшениц. Vrn-A1uисходный вариант, обусловливающий у пшениц «дикий» фенотип (озимость).

Согласно полученным результатам выявленные в образцах тетраплоидных пшениц аллельные варианты Vrn-A1b, Vrn-A1f , Vrn-A1e и Vrn-A1dic, по-видимому, произошли от одного исходного варианта, а именнно, аллеля Vrn-А1u дикого диплоидного вида T. urartu Thum. ex Gangil. путем накопления нуклеотидных замен и/или делеций. Эти результаты подтверждают ранее высказанное предположение о том, что T. urartu является донором А генома для всех тетраплоидных и гексаплоидных видов пшениц. Таким образом, были установлены последовательности промоторного района гена Vrn-А1 для 53 образцов тетраплоидных видов пшениц, а так же выявлен новый аллельный вариант Vrn-A1dic, и установлены эволюционные связи признака «яровость/озимость» возделываемых видов тетраплоидных пшениц с их дикими предковыми видами. Из 36 яровых образцов, для которых были выявлены нарушения в промоторе гена Vrn1, сформирована генетическая коллекция.


 

Проект 30.32. Изучение кэпинга теломер в клетках бурозубок (д.б.н. Н.С. Жданова)

Впервые было показано, что на хромосомах  бурозубок и крыс есть дисфункциональные теломеры, выявляющиеся с помощью антител к γ-H2AX. У Sorex granarius их более 30 на метафазу, а у вида близнеца Sorex araneus и крыс их число как и у человека не превышает пяти.

Рисунок. Дисфункциональные теломеры в метафазах эмбриональных фибробластах RNFF1 на 9-м (а) и 26-м пассажах культивирования (в). Теломеры выявлялись с помощью FISH c PNA теломерной пробой к Г-обогащенной нити теломерной ДНК (зеленый сигнал); γ-H2AX – иммунофлуоресценцией с соответствующими антителами (красный сигнал). Стрелки (а) и звездочки (в) указывают на сигналы γ-H2AX колокализованные с теломерами. Б и г профили колокализованных сигналов. На 9-м пассаже культивирования 3 дифункциональных теломеры и 5 дополнительных сигналов γ-H2AX на хромосомах, в основном в центромерных и притломерных районах. На 26-м пассаже – 7 колокализованных сигналов и множественные (22) дополнительные сигналы γ-H2AX на хромосомах.

 

Проект 30.33. Генетическая изменчивость видов и адаптация (д.б.н. И.К. Захаров)

Длительный мониторинг сборов из Миасса позволил нам впервые документировать появление титульного вида комплекса Anopheles maculipennis в азиатской части России (Novikov, Vaulin, 2014). Ранее этот вид отмечался только в локальностях России (СССР), расположенных намного западнее (White, 1978; Новиков, Алексеев, 1989). Анализ совокупности имеющихся данных позволил проследить динамику расширения ареала вида Anopheles maculipennis с конца 1970-х годов. Расширение ареала этого вида на север и восток России связывается нами с эффектами глобального потепления. Работа выполнена совместно с кафедрой цитологии и генетики Томского государственного университета.

Расширение ареала малярийного комара Anopheles maculipennisОбласти: A – ареал Anopheles maculipennis по данным White, 1978; B – расширение ареала вида, реконструированное по Новиков, Алексеев 1989; С – расширение ареала вида до2010 г. (по Novikov, Vaulin, 2014). 


Проект 30.34. Реконструкция генных сетей стрессового ответа у растений (к.б.н. А.В. Кочетов)

Проведено исследование созданной в рамках проекта генетической модели – трансгенных растения Nicotiana tabacum с высоким уровнем РНКазной активности в апопласте на устойчивость к Phytophthora parasitica. Согласно полученным данным, S-подобные РНКазы апопласта могут быть задействованы в молекулярных механизмах устойчивости к фитопатогенам разных типов (вирусам, грибам и оомицетам). Каким образом эти ферменты способны ингибировать развитие вируса – не вполне понятно; скорее всего они способны проникать через мембрану фитопатогена и разрушать пул клеточных РНК – подобно некоторым представителям PR-белков (Филипенко и др., 2013). По результатам этой части работы можно сделать следующее заключение: по-видимому, S-подобные рибонуклеазы апопласта принимают участие в молекулярных механизмах защиты не только от фитопатогенных вирусов, но и от грибов.

 

Рисунок 1. Трансгенные растения табака характеризуются увеличенным уровнем активности S-подобной нуклеазы в апопласте (приведен спектр белков с РНКазной активностью), а также более выраженной устойчивостью к фитопатогенным оомицетам.

 

Проект 30.35. Создание и поддержание селекционных моделей доместикации и некоторых патологических состояний для изучения их генетических и эпигенетических механизмов (д.б.н. А.Л. Маркель)

Идентифицирован ген и его мутация, связанная с платиновым окрасом у лисиц, которая возникла в процессе промышленного разведения. Платиновый окрас имеет полудоминантный характер наследования и характеризуется летальностью в гомозиготном состоянии. Серебристо-чёрные лисицы, гетерозиготные по этому признаку имеют осветленный окрас и значительную белую пятнистость. В качестве гена-кандидата рассматривался KIT, мутации которого вызывают пятнистость у многих видов млекопитающих. У лисиц платиного окраса были обнаружены два вида транскриптов гена KIT отличающихся по длине.  Секвенирование гена KIT у лисиц платинового окраса выявило ОНП в первом нуклеотиде интрона 17. Однонуклеотидная замена A→G нарушает донорный сайт сплайсинга, что приводит к выпадению экзона 17, кодирующего часть консервативного домена тирозинкиназы. Анализ родословных показал полную косегрегацию платинового окраса с наличием A-аллеля у лисиц, тогда как все серебристо-чёрные лисицы стандартного окраса гомозиготны по G-аллелю.

Исследована транскрипционная активность генов, кодирующих α1А- и α2А-адренорецепторы, в структурах мозга и в тканях органов крыс гипертензивной линии НИСАГ и линии ГК (генетическая каталепсия) с пограничной гипертонией в молодом возрасте и при сформированной артериальной гипертензии с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. У крыс линии НИСАГ в 1,5-месячном возрасте обнаружено повышенное содержание мРНК альфа1А-АР в лобной коре. У крыс исследованных линий в возрасте 1,5 месяцев выявлена физиологическая корреляция между значением соотношения мРНК альфа1А-АР/альфа2А-АР в гипоталамусе с повышением артериального давления при стрессе. На основании увеличения экспрессии α1А-АР и снижения экспрессии α2А-АР в ткани почки, а также корреляционной зависимости этих изменений с повышением артериального давления делается заключение о связи изменений адренорецепторного звена почки общей для крыс линий НИСАГ и ГК, имеющих разные формы гипертонии со становлением гипертензивного состояния. Показано снижение экспрессии α1А- и повышение экспрессии α2А-адренорецепторов в отделах мозга 7-месячных крыс линии ГК, что указывает на снижение функциональной активности норадренергической системы мозга. Этого не наблюдается у крыс НИСАГ. Показана отрицательная связь значения коэффициента мРНК α1А-АР/ мРНК α2А-АР в продолговатом мозге с длительностью реакции каталептического застывания крыс ГК в полуторамесячном возрасте.

Обнаружены однонаправленные изменения экспрессии гена α1А-адренорецептора в лёгких у крыс линии НИСАГ и ГК, что указывает на сходство симпатической регуляции сосудов малого круга кровообращения у крыс сравниваемых гипертензивных линий.

Выявлен пониженный уровень мРНК гена α1А-адренорецептора в надпочечниках крыс линии ГК, свидетельствующий о понижении симпатической стимуляции железы.

 

Проект 30.36. Разработка и использование технологии ускоренного создания генотипов мягкой пшеницы, несущих пирамиды генов, ответственных за устойчивость к стрессовым факторам (д.б.н. Л.А. Першина)

С целью изучения фенотипического разнообразия, проявления хозяйственно-ценных признаков и устойчивости к грибным патогенам (на естественном фоне) проведены полевые испытания сформированных цитогенетически стабильных дигаплоидных линий с  чужеродным генетическим материалом в отдельных районах Новосибирской и Омской областях. Выделены дигаплоидные линии с повышенной, относительно стандартов, урожайностью и характеризующиеся устойчивостью к полеганию, устойчивостью к патогенам бурой ржавчины и слабой поражаемостью к патогенами мучнистой росы (рис 1) (контроль – сорт Саратовская 29). Эти линии в качестве перспективных включены в селекционные программы. 

Рисунок 1. Результаты отбора дигаплоидных линий, устойчивых к грибным патогенам: 1 – листовая пластинка растения дигаплоидной линии, устойчивой к патогенам бурой ржавчины; 2 – листовая пластинка растения сорта Саратовская 29 (контроль), пораженного патогенами бурой ржавчины; 3 – дигаплоидная линия мягкой пшеницы, носитель генетического материала Ag.elongatum  и S.cereale, устойчивая к патогенам бурой ржавчины; 4 – колосья двух продуктивных и устойчивых к полеганию и бурой ржавчине дигаплоидных линий, включенные в селекционный процесс. 

 

Проект 30.37. Взаимодействие октопаминового и инсулинового сигнальных путей в контроле репродуктивной функции насекомых (модель Drosophila) (д.б.н.
И.Ю. Раушенбах)

Впервые продемонстрировано наличие обратной связи в регуляции экспрессии dFOXO ювенильным гормоном. Действительно гипоморфная мутация гена dFOXO вызывает у молодых самок дрозофилы: (1) повышение уровня деградации ЮГ (рисунок 1А) и интенсивности ответа системы метаболизма ЮГ на тепловой (38оС) стресс (рисунок 1Б), (2) снижение устойчивости к тепловому стрессу, (3) снижение плодовитости. Эти параметры являются индикаторами уровня синтеза ЮГ и свидетельствуют о снижении последнего у самок dFOXO. Также показано, что ген dFOXO регулирует метаболизм ОА у самок D. melanogaster. У 1-дневных самок линии FOXO: (1) активность ЩФ, фермента, регулирующего пул предшественника ОА, тирозина, снижена (рисунок 2); (2) активность ТДК, фермента, лимитирующего скорость синтеза ОА, повышена; (3) активность OANAT, фермента деградирующего ОА, не изменена. Эти результаты свидетельствуют о том, что влияние инсулинового сигнального пути на метаболизм ОА у самок дрозофилы опосредуется ювенильным гормоном. 

Рисунок. 1. Влияние мутации dFOXO на уровень деградации и стресс-реактивность ЮГ у 1-дневных самок D. melanogaster линии FOXO и ее линии-предшественницы w1118 в норме и при тепловом стрессе. Здесь и на рис. 2 и 3 - ромб – достоверность отличий от самок с подавленной экспрессией dFOXO, звездочка – достоверность различий между подвергнутыми тепловому стрессу и контрольными мухами одного генотипа.

Рисунок 2. Влияние мутации dFOXO на (А) активность ЩФ в норме и при тепловом стрессе и (Б) стресс-реактивность ЩФ у 1-дневных самок D. melanogaster.


Проект 30.38. Унипарентные геномы как модули для оценки динамики генофондов природных популяций (д.б.н. Н.Б. Рубцов)

Проведенный в 2013 году анализ результатов кросс-гибридизации микродиссекционных ДНК-проб выявил более высокую концентрацию повторенных последовательностей, гомологичных ДНК С-положительных прицентромерных районов хромосом, в эухроматиновых районах половых хромосом относительно эухроматиновых районов аутосом. 

В таблице приведены метафазные хромосомы и сигналы кросс гибридизации in situ меченой прицентромерной ДНК хромосом других видов (приведены только половые хромосомы и аутосомы с максимальным сигналом).

Полученные данные указывают на существование отличий в эволюции ДНК половых хромосом и аутосом.

 

Проект 30.39. Поиск и перенос новых генов устойчивости к грибным болезням в яровые и озимые генотипы пшеницы (д.б.н. Е.А. Салина)

Генотипирование гибридных линий T. aestivum/T. durum и T. aestivum/T. dicoccum выявило хромосомы с высокой и низкой частотой интрогрессии геномов тетраплоидных пшеницы в хромосомы мягкой пшеницы. Так, более 80% гибридных линий из комбинаций скрещивания с T. durum содержат фрагменты интрогрессий в хромосомах 1A, 2А, 3A, 3В, 5В и 7В (рисунок). Низкий уровень интрогрессии отмечается для хромосом 4А и 4В, при этом у линий, полученных с участием T. dicoccum, не выявлены фрагменты интрогрессии в хромосоме 4А. Также следует отметить, что фрагменты генома тетраплоидных пшениц в хромосомах 5А и 7B обнаруживаются только в длинных плечах хромосом. Анализ локализации чужеродных фрагментов в сочетании с литературными данными о локализации генов устойчивости к грибным патогенам позволяет предположить что «целевые» локусы, определяющие устойчивость гибридных линий, локализованы в хромосомах, характеризующихся высокой частотой интрогрессий.

Рисунок. Частота интрогрессий фрагментов генома T. durum и T. dicoccum в различные хромосомы гибридных линий.

 

Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН Б.21 «Основы фундаментальных исследований нанотехнологий и наноматериалов» (координатор – акад. Ж.И. Алферов)

Проект 24.56. Эллипсометрическое изучение закономерностей модуляции поверхност­ного плазмонного резонанса различными биологическими субстратами для разработки новых подходов к диагностике заболеваний человека (чл.-корр. РАМН М.И. Воевода)

Продолжены измерения констант скоростей специфических взаимодействий типа антиген-антитело с помощью спектральной эллипсометрии в условиях наблюдения поверхностного плазмонного резонанса: проанализировано взаимодействие моноклональных антител СD 24 с антигенами сыворотки крови пациентов с колоректальным раком (КРР) разных стадий и в динамике терапии. Детекцию белка CD24 в сыворотках крови обследуемых проводили при помощи прибора ProteOn XPR36 (BioRad, США). Концентрация антигенов в сыворотке крови обследуемого к предварительно иммобилизованным антителам CD24 пропорциональна уровню связывания на полученных кривых.

В исследованных образцах концентрации антигенов у здоровых людей и больных с колоректальным раком к CD24 достоверно отличаются в ~6 раз: 37.46±8.34   RU у доноров против 222.44±19.7  RU в общей группе пациентов с КРР (n=26) (p<0.0001). По выявленным данным концентрации антигенов к CD24 в сыворотке крови у больных в терминальных стадиях КРР ~ в 8.8 раза отличались от здоровых обследуемых и более, чем в 2 раза от пациентов с начальными стадиями заболевания. Следует отметить, что в динамике проводимой терапии отмечено достоверное снижение концентрации белка по сравнению с состоянием при поступлении (p<0.001). Вместе с тем, этот уровень антигенов к CD24 у пациентов, подвергшихся лечению, оставался достоверно выше такового у здоровых и больных КРР в стадии Т1-2 (p<0.0001). Следует подчеркнуть, что уровень концентрации антигенов к CD24 у больных КРР в уже начальных стадиях (Т1-2) отличался от такового у здоровых ~ в 3.8 раза (p<0.001). Полученные данные позволяют считать данную методику перспективной в диагностике ранних стадий колоректального рака. Для установления сопоставимости получаемых результатов проведено параллельное исследование сывороток пациентов с колоректальным раком. Полученные данные подтвердили достаточный уровень сопоставимости полученных результатов.             Тонкие пленки, полученные из сывороток крови пациентов с КРР, отличались неравномерностью распределения по пластине, гетерогенностью по толщине и показателю преломления, которые нарастали по мере утяжеления заболевания (р<0.05). В начальных стадиях КРР отмечалось недостоверное нарастание толщины пленок по сравнению с контролем, с нарастанием стадии заболевания происходило достоверное снижение толщины пластин (р<0.001). Показатель преломления нарастал от начальных к терминальным стадиям процесса (р<0,001-0.05). Выявлены корреляции показателя преломления с наличием отдаленных метастазов (r=0.64, p<0.033). Положительная динамика в процессе проведения противоопухолевой терапии ассоциировалась со снижением гетерогенности тонких пленок, уменьшением количества и глубины разрывов в них, нарастанием толщины и снижением показателя преломления  (р<0,001-0.05).         Проведено исследование образцов сыворотки крови больных колоректальным раком с помощью метода спектроскопии комбинационного рассеяния света (Raman спектроскопии). В области 1005-1520 см-1 выявлено достоверное снижение интенсивности пиков Raman-спектров у пациентов с КРР по сравнению с группой контроля (р<0.0001-0.01), что коррелировало со стадией процесса (r=-0.82, p<0.002) и эффектом проведенной противоопухолевой терапии (r=0.91, p<0.013).

Проведен анализ ассоциаций оптических характеристик тонких пленок на основе сыворотки крови с биохимическими параметрами сывороток крови у пациентов с КРР. Установленные корреляции могут быть с успехом использованы в ранней диагностике заболеваний.

 

Проект 24.59. Исследование подавления экспрессии гена in vivo олигонуклеотидами, комплементарными к мРНК гена-мишени, иммобилизованными на наночастицах биодеградируемых полимеров радиационным способом (чл.-корр. РАН Н.Н. Дыгало)

Наночастицы, полученные радиационным способом на основе олигосахаридов, содержащих олигонуклеотиды, при введении в головной мозг тормозили рост неонатальных животных. По отдельности ни олигонуклеотиды, ни декстран такого действия не оказывали. Специфический эффект именно нанокомплексов на рост животных может быть обусловлен более активным поступлением в клетки комплексов, чем каждого из их компонентов: декстрана или олигонуклеотидов.

Для проверки этого предположения исследовали поступление в клетки головного мозга неонатальных животных наночастиц, полученных радиационным способом на основе олигосахаридов и олигонуклеотидов, несущих флуоресцентную метку. Установлено, что в нанокомплексах с декстраном олигонуклеотиды значительно лучше поступают в клетки мозга, чем такие же меченные флуоресцентной меткой олигонуклеотиды, но не включенные в нанокомплексы (Рис.1). 

 

Рис. 1. Локализация наночастиц, полученных сшивкой олигонуклеотидов (Am), несущих флуоресцентную метку, с декстраном (Dextran) радиационным способом (верхний ряд фотографий), а также свободных олигонуклеотидов (нижний ряд фотографий) в клетках головного мозга неонатальных животных.

Препараты вводили в мозг крысятам на 6 день жизни. Локализацию препаратов в мозге анализировали через 24 ч после введения. FITC – фотография в зеленом канале флуоресцентной метки олигонуклеотидов. DAPI – фотография в синем канале окраски на нуклеотидный материал, в том числе и ядер клеток. MERGE – совмещение первых двух изображений. Стрелками отмечены некоторые организованные скопления олигонуклеотидов в клетках. Линейка – 10 мкм.

В нанокомплексах с декстраном олигонуклеотиды поступают в значительную часть клеток мозга, и лишь небольшое их количество остается в межклеточном пространстве. В отличие от комплексов, свободные олигонуклеотиды поступают в существенно меньшее число клеток и их пропорция: [(в клетке)/(в межклеточном пространстве)], в 3 раза ниже, чем для нанокомплексов (F=10,10; p<0,01).

Результат демонстрирует, что радиационная сшивка олигонуклеотидов с олигосахаридами может быть применена для повышения эффективности доставки ген-нацеленных олигонуклеотидных препаратов в клетки головного мозга.

 

Проект 24.62. Разработка фундаментальных основ определения масс наночастиц и биополимеров, недоступных современным методам масс-спектрометрического анализа (акад. Н.А. Колчанов, к.б.н. С.Е. Пельтек)

С помощью диффузионного спектрометра аэрозолей были проведены измерения размеров фрагментов ДНК фага λ  длиной 1489, 2027, 2322, 3472, 4361, 6557, 9416, 23130, ДНК фагов Т7 39936 и λ 48502 и  плазмиды pUC18 2686 нуклеотидных пар, переведенных  в газовую фазу методом мягкой неразрушающей  абляции под действием терагерцового излучения (рис. 1).  Сопоставление измерений диффузионных размеров аэрозольных частиц плазмиды pUC18 и измерений с нативных молекул помощью атомно-силовой микроскопии  дают основания предполагать, что в газовой фазе происходит процесс конденсации молекул ДНК. Построена модель процесса конденсации ДНК и формирования глобулы. Как видно из рисунка, наименьшие размеры имеют аэрозольные частицы, образованные фрагментами ДНК длиной до 10000 п.н., наибольшие аэрозольные частицы образованы фрагментами ДНК длиной 23130 п.н. и полными линейными геномами фагов Т7 и λ. Экспериментальные точки соответствуют укладке ДНК с персистентной длиной в 0,5 нм,  что свидетельствует об отсутствии распределённого заряда на поверхности ДНК в газовой фазе и неионизирующем характере терагерцового излучения. Исследование конформационных состояний ДНК в газовой фазе позволит расширить знания о закономерностях компактизации ДНК в естественных и искусственных условиях [1].

Была изготовлена и апробирована специальная камера для получения молекулярных ионов биополимеров, переведенных в газовую фазу под действием терагерцового излучения.  Основной частью камеры является сильфонный узел тарельчатого типа, предназначенный для перемещения пластины для позиционирования образцов в вакууме(рис. 2).  Это устройство позволяет последовательную абляцию до семи образцов и измерение их масс в времяпролетной системе при разовой откачке системы до рабочего вакуума [2].

  

 

Скачать документ в формате docx