2013 год

РЕЗУЛЬТАТЫ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ РАБОТ ПО «БАЗОВЫМ» ПРОЕКТАМ


Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.1.Генетические основы эволюции и селекции: механизмы изменчивости, генетическое разнообразие и методы создания нового исходного материала для генетико-селекционных исследований (координатор акад. В.К. Шумный)

VI.53.1.1. Генетическое разнообразие возделываемых растений как основа эволюции и селекции (координатор чл.-корр. РАСХН Н.П. Гончаров)

Серьезной проблемой при селекции большинства сельскохозяйственно важных культур, в том числе и мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.), является их крайне малое генетическое разнообразие. C использованием молекулярно-биологических и лабораторных методов определены эффективные гены Lr, контролирующие устойчивость к бурой ржавчине у искусственных амфиплоидов мягкой пшеницы. Показано, что для эффективного контроля признака «устойчивость к бурой ржавчине» необходимо и достаточно наличия в одном сортообразце одновременно двух генов Lr, обусловливающих проявление признака.

Рис. 1. Результаты оценки амфиплоидов по устойчивости к бурой ржавчине в фазе проростков (выполнено совместно с к.б.н. Е.И. Гультяевой, ВИРЗ, СПб-Пушкин) лабораторным методом инокуляции отрезков листьев по методу Михайловой и Квитко.


Рис. 2. Идентификация 1АL·1RS транслокации у искусственных амфиплоидов мягкой пшеницы. Микросателлитный маркер SCM9 является универсальным для отбора сортов с такой пшенично-ржаной транслокацией (Weng et al., 2007). Наличие фрагмента у двух из исследованных образцов обозначено стрелками (↓).

Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.1. Генетические основы эволюции и селекции: механизмы изменчивости, генетическое разнообразие и методы создания нового исходного материала для генетико-селекционных исследований (координатор акад. В.К. Шумный)
VI.53.1.2. Микроэволюционные процессы в популяциях видов разных таксонов (координатор д.б.н. И.К. Захаров)

Опухолевый супрессор lethal(2)giant larvae(lgl) у Drosophila melanogaster наряду с защитой от формирования неопластических опухолей влияет на развитие, жизнедеятельность и приспособленность. В стрессовых температурных условиях мутантные гетерозиготы lgl/+ приобретают преимущества перед гомозиготами +/+ по выживаемости и продолжительности жизни имаго. Дополнительная доза гена l(2)gl вызывает цитоплазматическую несовместимость, сходную с действием внутриклеточного эндосимбиота Wolbachia. Обнаружено сходство между действием на продолжительность жизни хозяина Drosophila melanogasterв присутствии Wolbachia и понижением дозы онкосупрессора lgl. В обоих случаях наблюдается увеличение продолжительности жизни лишь при температурном стрессе, и этот позитивный эффект пол-специфичен.

Рис. 3. При температурном стрессе продолжительность жизни (ПЖ) дрозофил увеличивается при понижении дозы онкосупрессора lgl и заражении Wolbaсhia.

а – материнский эффект изменения ПЖ у мутантных гетерозиготных самцов линии lgl558; б – позитивное влияние Wolbahia на ПЖ зараженных самок (W+) линии Bi90.

Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.1. Генетические основы эволюции и селекции: механизмы изменчивости, генетическое разнообразие и методы создания нового исходного материала для генетико-селекционных исследований (координатор акад. В.К. Шумный)

VI.53.1.3. Генетический контроль механизмов несовместимости между растениями разных таксонов и их адаптации к неблагоприятным условиям среды (координатор д.б.н. Л.А. Першина)

На примере изучения интрогрессивных линий озимой пшеницы Alcedo – носителя генетического материала хромосом 2АS, 2BS, 3BL, 4AL и 6DL дикорастущего тетраплоида Aegilops markgrafii, впервые показано, что дикорастущие сородичи мягкой пшеницы могут быть донорами генов, улучшающих технологические свойства зерна и муки. В отличие от исходного сорта пшеницы Alcedo, интрогрессивные линии могут быть отнесены к «сильным» сортам пшеницы.

Рис. 4. Содержание клейковины (А) и физические свойства теста (Б) в линиях озимого сорта Alcedo с интрогрессиями от дикого злака Ae. markgrafii.

Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.1. Генетические основы эволюции и селекции: механизмы изменчивости, генетическое разнообразие и методы создания нового исходного материала для генетико-селекционных исследований (координатор акад. В.К. Шумный)

VI.53.1.4. Молекулярная и функциональная организация и эволюция хромосом эукариот (координатор д.б.н. Н.Б. Рубцов)

Разработан метод, обеспечивающий идентификацию материала индивидуальных хромосом у видов, обладающих геномами, по размеру значительно превышающими геномы млекопитающих. Метод заключается в проведении специальной компьютерной обработки микроизображений двухцветной флюоресцентной гибридизацией in situ (FISH) микродиссекционных ДНК-проб, полученных из индивидуальных хромосом или хромосомных районов, с препаратами метафазных или мейотических хромосом, обеспечивающей вычитание из общего сигнала FISH сигнала, обусловленного гибридизацией диспергированных повторенных последовательностей. Оценка эффективности метода была проведена на хромосомах человека и использована в исследованиях формирования половых хромосом у ряда видов саранчовых (рис.).

 

Рис. 5. FISH микродиссекционных ДНК-проб, полученных из хромосом X и Y кузнечика Nocaracris cyanipes c мейотическими хромосомами этого вида.

Слева – исходное изображение, справа – изображение после компьютерной обработки, обеспечивающей вычитание сигнала, обусловленного гибридизацией диспергированных повторенных последовательностей (зеленый сигнал – WCPY, красный сигнал – WCPX, синий сигнал – окраска ДНК красителем DAPI).

Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.1. Генетические основы эволюции и селекции: механизмы изменчивости, генетическое разнообразие и методы создания нового исходного материала для генетико-селекционных исследований (координатор акад. В.К. Шумный)

VI.53.1.5. Геном злаков: изучение организации и вклада отдельных участков хромо-сом и генных локусов в проявление признаков и формообразование (координатор д.б.н. Е.А. Салина)

Особенности развития соцветия мягкой пшеницы T. aestivum L., колоса, отражаются на морфологии и могут оказывать непосредственное влияние на элементы продуктивности. Выявлены и изучены гены, контролирующие развитие колоса на стадии формирования колоска, с использованием серии генетически независимых мутантных линий пшеницы. Все мутантные линии характеризуются развитием дополнительных колосков в уступах колосового стержня или многоколосковостью (a). В результате молекулярно-генетического картирования установлен основной вклад в генетический контроль изучаемого признака генетического локуса хромосомы 2DS (в). С применением методов современной молекулярной генетики и геномики установлен ген-кандидат и впервые определена его первичная структура у мягкой пшеницы (г). Обнаружено, что мутантный фенотип связан с миссенс-, нонсенс- и нуль-мутациями данного гена у изучаемых мутантов (д). При помощи электронной микроскопии показано, что данные мутации приводят к аномалиям развития колоса, связанным с развитием эктопических колосковых меристем на месте цветковых меристем (б).


Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.2. Молекулярно-генетические механизмы регуляции физиологических функций, поведения и процессов доместикации (координатор акад. Л.Н. Иванова)

VI.53.2.1. Иммуногенетические механизмы межорганизменных взаимодействий в репродуктивном цикле млекопитающих как фактор изменчивости потомков (координатор д.б.н. М.П. Мошкин)

Исследована модуляция хемосигналами процессов захвата и транспортировки обонятельными нейронами наноразмерных аэрозолей. Стимуляция самцов мышей половыми феромонами (2,5-диметилпиразин или моча самок) усиливает поглощение введенных в носовую полость наночастиц MnO рецепторами вомероназального органа (ВНО), что приводит к росту интенсивности томографического сигнала в дополнительной обонятельной луковице, в которую проецируются нервные окончания рецепторов ВНО (рис.). Таким образом, предложен новый подход к количественной оценке нейрональной реакции на репродуктивные стимулы, а также показана возможность феромонального управления траекторией перемещения наночастиц из носовой полости в головной мозг.


Рис. 6. Влияние половых феромонов на траекторию перемещения наночастиц гидроксидов марганца [MnO*(H2O)x] из носовой полости в головной мозг. А – положение дополнительной обонятельной луковицы [ДОЛ – accessory olfactory bulb (AOB)] на магнитно-резонансной томограмме (МРТ) обонятельных луковиц мыши;

B – схема нервных связей вомероназального органа [vomeronasal organ (VNO)] с ДОЛ (AOB) и подкорковыми ядрами; C – интенсивность МРТ сигнала (псевдоокрашивание – зеленый соответствует максимуму) в обонятельных луковицах при введении наночастиц в правую ноздрю; D – интенсивность МРТ сигнала (псевдоокрашивание) в обонятельных луковицах при одновременном введении в правую ноздрю наночастиц и образцов мочи эстральных самок; E – разница МРТ сигнала в ДОЛ и основной (ООЛ) обонятельных луковицах при введение наночастиц одновременно с физиологическим раствором (контроль), камфорой, феромоном самцов гептаноном, феромоном самок 2,5-диметилпиразином (2,5-ДМП) и мочой эстральных самок.

Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.2. Молекулярно-генетические механизмы регуляции физиологических функций, поведения и процессов доместикации (координатор акад. Л.Н. Иванова)

VI.53.2.2. Нейрогеномика психоповеденческих нарушений (координатор чл.-корр. РАН Н.Н. Дыгало)

Обнаружено, что глюкокортикоидный препарат, способный взаимодействовать как со специфическими глюкокортикоидными рецепторами (GR), так и с минералокортикоидными рецепторами (MR), в силу своего антиапоптозного потенциала, по крайней мере, в некоторых областях головного мозга, является более предпочтительным для предотвращения респираторного дистресс-синдрома новорожденных по сравнению с селективными агонистами GR. Превентивная глюкокортикоидная терапия в преддверии ожидаемого гипоксического состояния также является более предпочтительной по сравнению с постгипоксическим ее применением, поскольку при превентивной схеме негативные эффекты гормона на мозг нивелируются взаимодействием с гипоксическим фактором, являющимся естественным компонентом респираторного дистресс синдрома новорожденных.


Рис.7. Уровни антиапоптозного белка Bcl-xL(защищает клетки от гибели) в головном мозге крысят при пред- и постгипоксическом применении дексаметазона, используемого при терапии респираторного дистресс синдрома новорожденных.

Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.2. Молекулярно-генетические механизмы регуляции физиологических функций, поведения и процессов доместикации (координатор акад. Л.Н. Иванова)

VI.53.2.3. Исследование генетико-физиологических и молекулярных механизмов нейроэндокринной регуляции висцеральных функций и поведения, обеспечивающих гомеостаз (координатор акад. Л.Н. Иванова)

Известно, что мутация Ау влияет на пищевое поведение и углеводно-жировой обмен, что приводит к развитию ожирения и диабета 2 типа. Установлено, что у мышей линии С57BL/6J c мутацией Ау эмоциональный стресс резко угнетает аппетит (анорексия), снижает веса тела и показатели углеводного обмена, о чем свидетельствует снижение уровня инсулина в крови. Резкое снижение потребления пищи у Ау/а мышей при стрессе может быть обусловлено угнетением меланокортиновой системы мозга и компенсаторным усилением активности механизмов, ответственных за развитие стрессорной анорексии. Изучение механизмов нарушения пищевого поведения при стрессе актуально для поиска подходов к лечению ожирения у человека.

 

Рис.8. Потребление пищи и уровень инсулина в крови у мышей с меланокортиновым ожирением (Ay/a генотип) и контрольных мышей (а/а генотип) в состоянии покоя и через 3 часа после стресса (1 ч рестрикция). * P < 0,05 – различие между генотипами, # P < 0,05 различие между контролем и стрессом.

Приоритетное направление VI.53. Общая генетика. Программа VI.53.2. Молекулярно-генетические механизмы регуляции физиологических функций, поведения и процессов доместикации (координатор акад. Л.Н. Иванова)

VI.53.2.4. Молекулярно-генетические механизмы процесса доместикации, комплексных поведенческих, морфологических и физиологических признаков: экспериментальное исследование на селекционных моделях животных (координатор д.б.н. А.Л. Маркель)

Показано, что при генетической артериальной гипертонии (крысы линии НИСАГ) в почках усилена экспрессия гена фермента эпоксидгидролазы (SHE), которая переводит активные вазодилятаторы (EETs) в неактивные соединения (DHETEs). Это приводит к нарушениям почечной гемодинамики, повреждению почечных клубочков и стойкому повышению артериального давления.
Фермент почечная эпоксидгидролаза может рассматриваться как перспективная мишень для фармакологической блокады и лечения гипертонической болезни.


Рис.9 Почечный клубочек и его кровоснабжение (схематическое изображение).

Приоритетное направление VI.58. Молекулярная генетика. Механизмы реализации генетической информации. Биоинженерия. Программа VI.58.1. Механизмы регуляции экспрессии генов, сравнительные геномика и транскриптомика, фундаментальные основы нанобиоинженерии (координатор д.б.н. Т.И. Меркулова)

VI.58.1.1. Особенности формирования молекулярно-генетических механизмов метаболических нарушений и наследственных заболеваний у жителей Северной Азии и разработка новых подходов к их коррекции (координатор чл.-корр. РАМН М.И. Воевода)

Группа больных с метаболическим синдромом и контрольная группа (619 человек) были сформированы на основе популяционной выборки 45–69-летних жителей Октябрьского и Кировского районов г. Новосибирска. Геномную ДНК выделяли из венозной крови методом фенол-хлороформной экстракции. Полиморфизм генов тестировали с помощью ПЦР в реальном времени (зонды TaqMan, Applied Biosystems, USA) на приборе ABI 7900HT. В исследование были взяты следующие ОНП: rs28711149 гена OR13G1, rs499818 (хр. 6), rs619203 гена ROS1, rs10757278 и rs1333049 (хр. 9), rs1376251 гена TAS2R50, rs2549513 (хр. 16), rs4804611 гена ZNF627 и rs17465637 гена MIAF3, rs7903146 гена TCF7L2, rs2237892 гена KCNQ1, rs9939609 гена FTO, rs10811661 гена CDKN2A/B. С метаболическим синдромом оказались ассоциированы: rs10811661 гена CDKN2A/B, р = 0,019 (рис.); rs499818 (6 хр.); rs7903146 гена TCF7L2 у женщин, rs4804611 гена ZNF627 у женщин; rs2549513 (хр. 16) у мужчин.

Рис.10. Частоты генотипов rs10811661 в контроле  и в группе с метаболическим синдромом.

Приоритетное направление VI.58. Молекулярная генетика. Механизмы реализации генетической информации. Биоинженерия. Программа VI.58.1. Механизмы регуляции экспрессии генов, сравнительные геномика и транскриптомика, фундаментальные основы нанобиоинженерии (координатор д.б.н. Т.И. Меркулова)

VI.58.1.2. Молекулярно-генетические основы транскрипционной регуляции (координатор д.б.н. Т.И. Меркулова)

Разработан оригинальный подход к выявлению потенциально регуляторных SNPs (rSNPs) в геноме человека. Подход основан на данных международного проекта ENCODE (ChIP-seq анализ) и предположении о том, что SNPs, попадающие в район генома, где перекрываются несколько участков связывания факторов транскрипции (пиков ChIP-seq), являются rSNPs (рис., а). Анализ выборок SNPs, связанных с фенотипическими проявлениям, показал, что они существенно обогащены предсказанными нами rSNPs по сравнению с массивами случайно отобранных SNPs (рис., б). Методом задержки в геле показано, что 88 % выявленных таким образом SNPs меняют картину связывания транскрипционных факторов, т. е. действительно являются регуляторными (рис., в). 


Приоритетное направление VI.58. Молекулярная генетика. Механизмы реализации генетической информации. Биоинженерия. Программа VI.58.1. Механизмы регуляции экспрессии генов, сравнительные геномика и транскриптомика, фундаментальные основы нанобиоинженерии (координатор д.б.н. Т.И. Меркулова)

VI.58.1.3. Метаболомно-протеомное профилирование молекулярно-генетических систем и процессов (координатор к.б.н. С.Е. Пельтек)

Из водной пробы высокотемпературного выхода (97 °С), находящегося в долине Гейзеров в районе гейзера Тройного, выделен штамм нового вида термофильных бактерий.
Колонии и клетки исследуемого штамма типичны для представителей рода Geobacillus (рис.). Установлено, что штамм G1w1 отличается от остальных штаммов Geobacillus spp., имеющихся в базе данных ИЦиГ СО РАН, наличием пиков с массами 2887, 5603, 5895, 6897, 10137 и 10595 Да. Филогенетическое дерево, построенное на основании последовательностей 16S рРНК типовых штаммов рода Geobacillus, а также наиболее близких к исследуемому штамму последовательностей, взятых из базы данных GenBank, не позволил отнести штамм G1w1 к какому-либо известному виду рода Geobacillus.

Подробное морфологическое, биохимическое, филогенетическое, филопротеомное изучение штамма Geobacillus icigoviae sp., а также его полногеномное секвенирование позволили отнести его к новому виду бактерий рода Geobacillus.


Рис.11. Geobacillus icigoviae sp. nov. – новая термофильная бактерия из горячего источника Камчатки.

Приоритетное направление VI.60. Клеточная биология. Теоретические основы клеточных технологий. Программа VI.60.1. Геномные и эпигенетические процессы  клеточной дифференцировки и разработка способов управления этими процессами (координатор д.б.н. О.Л. Серов)

VI.60.1.1. Молекулярные механизмы патологических процессов: роль описторхид в канцерогенезе (координатор д.б.н. В.А. Мордвинов)

Впервые были выделены и проаннотированы последовательности кДНК для 356 белков трематоды O. felineus. Среди этих белков выявлены белки-гомологи, перспективные в качестве мишеней для разработки методов диагностики и терапии описторхоза. На экспериментальной модели описторхоза, вызванного O. felineus у хомячков Mesocricetus auratus (рис., а), показано, что в процессе заболевания заметны разной степени нарушения структуры печеночных долей и желчных протоков в разных экспериментальных группах (рис., б).

Рис.12. Результаты моделирования экспериментального гепатоканцерогенеза, ассоциированного с воздействием O. felineus и диметилнитрозамина.

а – 156 животных распределены по 4-м группам: контрольные животные, животные, получающие 12,5 ppm ДМН (ДМН), животные, зараженные 50 метацеркариями O. felineus (OF), и животные, подверженные сочетанному воздействию 12,5 ppm ДМН и 50 метацеркарий O. felineus (ДМН + OF); б – нарушения структуры печеночных долей и желчных протоков; в – препараты срезов печени животных четырех групп на 10-й и 26-й неделях (окраска гематоксилином и эозином) и схема соотношения между общими и специфичными для экспериментальных групп гепатопатологиями.

В результате сравнительного гистологического анализа печени животных 4 групп можно заключить, что фиброз и полипозные разрастания эпителия, блокирующие просвет желчных протоков, появляются в группе (OF); нарушения, затрагивающие паренхиму печени, появляются в группе (ДМН), формирование же злокачественных опухолей желчевыводящих путей индуцируется при сочетанном воздействии химического мутагена диметилнитрозамина (ДМН) и паразита O. felineus (рис., в).

Приоритетное направление VI.60. Клеточная биология. Теоретические основы клеточных технологий. Программа VI.60.1. Геномные и эпигенетические процессы  клеточной дифференцировки и разработка способов управления этими процессами (координатор д.б.н. О.Л. Серов)

VI.60.1.2. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Эксперименталь-ное использование клеточных технологий для воспроизводства и коррекции патологических состояний (координатор д.б.н. С.М. Закиян)

Установлено, что плюрипотентные стволовые клетки человека характеризуются различным эпигенетическим статусом Х-хромосом, который демонстрирует высокую динамичность и нестабильность. Обнаружено отсутствие четкой связи между характеристиками хроматина и транскрипционной активностью генов Х-хромосомы. В частности, показано, что, несмотря на активный хроматин, транскрипция генов на одной из двух Х-хромосом может быть инактивирована. Предложены подходы для детекции транскрипционной активности генов Х-хромосом в линиях ИПСК и их дифференцированных производных методом РНК-иммунофлюоресцентной гибридизации in situ и олигонуклеотидного циточипа.

 

Рис.13. Статус Х-хромосом в ИПСК человека. Обе Х-хромосомы в линии плюрипотентных клеток с двумя активными Х-хромосомами обнаруживают модификации активного хроматина H3K4me2 (А), а также экспрессию генов на обеих Х-хромосомах (Б, Chr X). На неактивной Х-хромосоме отсутствуют модификации активного хроматина H3K4me2 (Г), экспрессируется ген XIST и выявляются модификации неактивного хроматина H3K27me3 (В, Е). CEP X – специфический зонд на центромерный район Х-хромосомы.

Приоритетное направление VI.60. Клеточная биология. Теоретические основы клеточных технологий. Программа VI.60.1. Геномные и эпигенетические процессы  клеточной дифференцировки и разработка способов управления этими процессами (координатор д.б.н. О.Л. Серов)

VI.60.1.3. Генетические и эпигенетические механизмы, регулирующие дифференцировку, трансдифференцировку и репрограммирование (координатор д.б.н. О.Л. Серов)

Получены новые данные о механизмах эпигенетического контроля процессов дифференцировки и репрограммирования стволовых клеток. Созданы экспериментальные подходы для внесения заданных модификаций в геном стволовых клеток. Впервые описаны принципы пространственной организации генома половых клеток (сперматозоидов). Установлено, что плюрипотентные стволовые клетки человека характеризуются различным эпигенетическим статусом Х-хромосом.
Анализ пространственной организации генома сперматозоидов и фибробластов мыши с помощью метода Hi-C показал, что их трехмерная архитектура имеет не только значительное сходство в общей организации, но и существенные различия. Впервые показано, что вероятность внутрихромосомных контактов в сперматозоидах падает с расстоянием по закону s 1,06, а в фибробластах это значение равно s 1,21 (рис.).

Рис.14. График зависимости вероятности внутрихромосомных контактов от дистанции вдоль хромосомы. Fib – эмбриональные фибробласты мыши, Sp – сперматозоиды мыши, GM100 – линия лимфобластоидных клеток человека. Данные из: (Liberman-Aiden et al., 2009).

Приоритетное направление VI.61. Биофизика. Радиобиология. Математические модели в биологии. Биоинформатика. Программа VI.61.1. Молекулярно-генетические, биофизические, экосистемные и биосферные процессы: информационные системы, экспериментально-компьютерный анализ и моделирование (координаторы акад.
Н.А. Колчанов, акад. А.Г. Дегерменджи)

VI.61.1.1. Компьютерно-экспериментальное исследование и моделирование струк-турно-функциональной организации и эволюции генных сетей многоклеточных и одноклеточных организмов (координатор акад. Н.А. Колчанов)

Сконструированы компьютерные модели ингибиторов образования комплекса FADD/procaspase-8, препятствующие запуску апоптозной гибели клетки. Низкомолекулярные соединения, ингибирующие процесс образования комплекса FADD с procaspase-8, представляют большой интерес для создания лекарств, останавливающих программируемую смерть клеток, а также изучения фундаментальных механизмов запуска клеточного апоптоза и активации NF-KB пути. Проведен виртуальный скрининг по библиотеке коммерчески доступных соединений ZINC потенциальных ингибиторов образования комплекса FADD/procaspase-8. В ЯМР структуре рецептора (pdb id: 2GF5) определена гидрофобная полость, находящаяся вблизи аминокислот, критических для связывания белка FADD с procaspase-8. В результате компьютерного скрининга отобраны 30 лигандов для дальнейшей экспериментальной проверки, обладающих наибольшей способностью, согласно предсказаниям, ингибировать образование белковых комплексов procaspase-8 и DED FADD (рис.).


Рис. 15. Результат компьютерного скрининга ингибиторов образования комплекса FADD/procaspase-8.

А – структура белка FADD (pdbid: 2GF5). Показан сайт связывания потенциального лиганда в комплексе с потенциальным ингибитором. Аминокислоты, критические для образования комплекса с procaspase-8, показаны красным цветом. Б – наложение конформаций рецептора. Показан потенциальный связывающийся лиганд, имеющий высокую аффинность ко всем конформациям рецептора. В – наложение найденных лигандов в результате виртуального скрининга по одной из конформаций рецептора.

Приоритетное направление VI.62. Биотехнология. Программа VI.62.1. Фундаментальные основы биотехнологий создания средств терапии и диагностики заболеваний (координатор акад. В.В. Власов)

VI.62.1.5. Разработка и совершенствование генетических конструкций для оптимизации экспрессии целевых генов и синтеза рекомбинантных белков медицинского назначения у трансгенных растений и животных (координатор д.б.н. Е.В. Дейнеко)

Для усиления экспрессии целевых генов у трансгенных растений создана серия генетических конструкций с промоторами (apetala3 и prs4A) тканеспецифичных генов
A. thaliana на основе плазмиды pNPB-TS (а), обеспечивающих экспрессию репортерного uidA-гена в активно делящихся клетках табака: в зоне апикальных (б) и корневых (в) меристем, а также в клетках каллуса (г). Для усиления иммуногенности в генетической конструкции с геном ESAT6-CFP10-dIF последовательность дельта-интерферона (dIF) была заменена последовательностью бета-субъединицы холерного токсина CTB (д).

У двух линии мышей (#78 и #83) методом TAIL-PCR установлена встройка трансгенов, кодирующих ген фактора кроветворения человека Г-КСФ, в функциональный район аутентичного гена 8 хромосомы и в гетерохроматиновый район прицентромерной зоны 12-й хромосомы (е, ж). Экспрессия Г-КСФ человека в молоке обеих линий мышей была стабильной и составила 60 мкг/мл и 38 мкг/мл соответственно. Эктопическая экспрессия трансгена в эмбриональном развитии трансгенных мышей отсутствовала.

a – схема генетической конструкции для тканеспецифической экспрессии трансгенов в растениях;
б, в – uidA-экспрессия (голубое окрашивание) в апикальной меристеме и меристеме корней у проростков трансгенных растений табака; г – uidA-экспрессия (голубое окрашивание) в каллусных тканях; д – схема генетической конструкции, содержащей последовательность CTB. (Обозначения: RB и LB – повторы, окаймляющие Т-область плазмиды; pNOS – промотор гена нопалинсинтазы Тi-плазмиды A. tumefaciens; nptII – ген неомицинфосфо-трансферазы II E.coli; tNOS – терминатор гена нопалинсинтазы Тi-плазмиды A. tumefaciens; CaMV35S – промотор гена 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; cfp10 – последовательность гена cfp10 M. tuberculosis; esat6 – последовательность гена esat6 M. tuberculosis; СTB-последовательность; uidA – последовательность гена бета-глюкуронидазы E. coli). e – идиограмма хромосом 8 и 12 с указанием сайтов интеграции (стрелки) трансгена; ж – нуклеотидные последовательности генома, фланкирующие трансген.

РЕЗУЛЬТАТЫ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ РАБОТ ПО ПРОГРАММАМ ПРЕЗИДИУМА РАН


Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН А.II.3 «Химические аспекты энергетики» (координатор – акад. И.И. Моисеев)

Проект 13. Поиск, селекция и изучение перспективных бактериальных штаммов-проду­центов для переработки глицерина (акад. Н.А. Колчанов)

В результате проведенного исследования гидротерм Камчатки с целью поиска микроорганизмов, способных к эффективной утилизации глицерина при повышенных температурах, установлено, что в термальных источниках Долины гейзеров и кальдеры Узон развиваются микроорганизмы, способные к росту на средах с глицерином. Выделены штаммы, способные к переработке глицерина. Методами параллельного секвенирования проведено исследование микробиологического разнообразия серии термальных выходов в Долине гейзеров. Выявлено, что по мере понижения температуры увеличивается микробное разнообразие в различных зонах исследуемой точки. Наибольшие видовое разнообразие наблюдается в зоне с температурой 22 °С. В зонах с наиболее высокой температурой преобладают бактерии, относящиеся к строго термофильным типам: Aquificae, Deinococcus-Thermus, Thermus и Chloroflexi.

В сентябре 2013 г. проведена экспедиция, посвященная изучению микробных сообществ Долины гейзеров и кальдеры Узон. В ходе экспедиции отобраны образцы воды, донных отложений и микробных матов из геотермальных источников, характеризующихся различными физико-химическими свойствами.  Из 51 пробы, отобранной в Долине гейзеров и кальдере Узон, проведены посевы для оценки численности микроорганизмов, способных к переработке глицерина. Установлено, что в 5 пробах имеются микроорганизмы, способные к росту на средах с глицерином (табл.1.).

Таблица 1

Численность микроорганизмов, способных к переработке глицерина, в природных пробах

Место отбора пробы

Характеристика места отбора пробы

Численность микроорганизмов, кл/мл

1

Г1

Долина гейзеров, водный котел, 96 °С

1,0 × 102

2

Г3

Долина гейзеров, ручей, 45 °С

0,8 × 102

3

У2-1

Кальдера Узон, водный котел, 92 °С

0,3 × 102

4

Г6

Долина гейзеров, водный котел, 96 °С

1,0 × 102

5

У скважина

Кальдера Узон, скважина антропогенного происхождения, 91 °С

2,7 × 102


Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН А.II.5 «Фундаментальные науки – медицине» (координатор – акад. А.И. Григорьев)

Проект ФНМ-7. Разработка новых терапевтических подходов к защите нейронов от дегенерации при действии стресса и его гормонов – глюкокортикоидов (чл.-корр. РАН  Н.Н. Дыгало)

Гормоны стресса глюкокортикоиды, применяемые при терапии респираторного дистресс-синдрома новорожденных, вместе со спасением жизни новорожденного нарушают формирование его головного мозга. Возможным подходом, способным предотвратить или ослабить эти негативные эффекты гормонотерапии, является применение совместно с глюкокортикоидами потенциальных нейропротекторов, например, таких как нейролептики, одним из классических представителей которых являются соли лития. Мы исследовали эффекты хлорида лития и дексаметазона на общее и психомоторное развитие крыс и экспрессию белков апоптоза в головном мозге неонатальных животных.

Установлено, что однократное введение хлорида лития (0–255 мг/кг) на 3 день жизни в зависимости от дозы замедляло прирост массы тела животных и тормозило появление реакции негативного геотаксиса в первые сутки после воздействия. Эффект наибольшей дозы нейролептика был сопоставим с эффектом дексаметазона. В ходе дальнейшего развития прирост массы тела восстанавливался у животных, получивших лишь малую дозу хлорида лития и препараты глюкокортикоидов, в то время как большие дозы нейролептика приводили не только к задержке развития, но и к последующей гибели животных (ЛД50 LiCl = 255 мг/кг, терапевтический индекс ≤ 3).

Токсическое действие дексаметазона выражалось увеличением уровня активной каспазы-3 в коре и стволе мозга через 5 суток после введения гормона, а также значительным снижением поведенческой активности животных. Нейропротекторное действие низких доз LiCl проявлялось восстановлением локомоторной активности неонатальных крысят, получавших дексаметазон совместно с нейролептиком (рис.).

Результаты работы свидетельствуют об апоптоз-опосредованном изменении устойчивости головного мозга к действию глюкокортикоидов. Выявлена возможность защиты клеток формирующегося головного мозга от гибели, индуцируемой глюкокортикоидами, путем применения хлорида лития совместно с дексаметазоном. Однако такая возможность является скорее теоретической, нежели практически применимой, поскольку LiCl имеет низкий терапевтический индекс (≤ 3) и его передозировка имеет тяжелые, вплоть до летальных, последствия.


Рис. 16. Локомоторная активность 8-дневных крысят на незнакомой площадке после введения им на 3-й день жизни физиологического раствора (физиол. р-р), дексаметазона (DEX) или дексаметазона совместно с нейролептиком (DEX+LiCl). * p < 0,05 по сравнению с физиологическим раствором.

Проект ФНМ-9. Создание клеточных моделей болезней, вызываемых экспансией тринуклеотидных повторов, с применением новейших технологий геномной инженерии (д.б.н. С.М. Закиян)

Для направленного повышения эффективности гомологичной рекомбинации в локусах генов HTT и FMR1 человека были созданы искусственные нуклеазы и никазы системы CRISPR/Cas9 (рис., А), вносящие, соответственно двуцепочечные и одноцепочечные разрывы ДНК вблизи трактов тринуклеотидных повторов. Работу конструкций, экспрессирующих CRISPR-нуклеазы, проверили путем временной трансфекции их в клетки линии 293Т. Нуклеазы направленно вносят двуцепочечные разрывы в ДНК, которые затем репарируются клеткой по механизму негомологичного соединения концов, после чего в месте соединения концов остаются короткие делеции/инсерции. Наличие делеций/инсерций можно зафиксировать при помощи теста с Т7 эндонуклеазой I (рис., Б). Проверка показала, что из 10 нуклеаз 8 способны направленно вносить двуцепочечные разрывы и могут быть использованы в дальнейшей работе.

Для проведения гомологичной рекомбинации были созданы донорные плазмидные конструкции на основе специальных плазмидных векторов, способных поддерживать нестабильную ДНК. Векторы были сконструированы по модульному принципу, содержали ориджин репликации pUC, ген ROP, маркер устойчивости к спектиномицину, а также три терминатора транскрипции (рис., В). Наращивание тракта тринуклеотидных повторов, а также его объединение с плечами гомологии произведено путем последовательного Golden Gate клонирования, что позволило создать фрагмент донорной ДНК, не содержащий «швов» и других посторонних последовательностей. В результате получены донорные конструкции FMR1_90rep и HTT_215rep. Размер и стабильность тракта тринуклеотидных повторов подтвердили анализом продуктов гидролиза эндонуклеазами SfoI и StuI соответственно (рис., Г), а также секвенированием.


Рис.17. Система для направленного внесения протяженных трактов тринуклеотидных повторов в гены FMR1 и HTT (пояснения в тексте).

Проект ФНМ-11. Ренин-ангиотензиновая система мозга – центральное звено регуляции водно-солевого гомеостаза и артериального давления: экспериментальное исследование на модели стресс-чувствительной артериальной гипертонии (акад. Л.Н. Иванова)

Как в гипоталамусе, так и в продолговатом мозге молодых крыс НИСАГ обнаружено повышенное содержание мРНК генов ангиотензиногена (Agt) и рецепторов второго типа (АТ2) (рис., а). В продолговатом мозге повышен уровень содержания мРНК рецепторов первого типа (АТ1А) ангиотензина II. Уровень экспрессии гена ангиотензин превращающего фермента второго типа (Асе2) был снижен в гипоталамусе. При этом уровень мРНК гена Сох-2 был повышен в обоих отделах мозга, а мРНК гена тирозингидроксилазы (Th) повышен только в гипоталамусе. Найденные изменения транскрипционной активности генов ренин-ангиотензиновой системы мозга лежат в основе нарушений центральной регуляции водно-солевого гомеостаза и повышения симпатического тонуса у гипертензивных крыс НИСАГ.



Рис.18. Уровень мРНК генов ренин-ангиотензиновой системы в гипоталамусе (а) и в продолговатом мозге (б) молодых крыс НИСАГ с формирующейся артериальной гипертонией по сравнению с нормотензивным контролем WAG. Данные представлены в виде средних значений по группе ± SEM. * p < 0,05.

Проект ФНМ-14. mTOR-сигнальный путь – новая мишень воздействий,  направленных на профилактику возрастзависимых нейродегенеративных заболеваний (д.б.н.
Н.Г. Колосова)


Цель первого этапа исследований – оценка профилактического нейропротекторного потенциала рапамицина – способности предупреждать ускоренное старение мозга в период манифестации его первых признаков. Для ее достижения проведено исследование по подбору оптимальной дозировки препарата, не подавляющей иммунную систему животных. С этой целью крысы OXYS и контрольные крысы Вистар в возрасте 1,5–3 месяцев – критический период развития признаков преждевременного старения у крыс OXYS – получали рапамицин в различных дозах. Оценивали моторно-исследовательскую активность в тесте «открытое поле», уровень тревожности в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт», морфологические параметры мозга методами магниторезонансной томографии (МРТ) на томографе «BioSpec 117/16» (Bruker, Germany). Установлено, что эффекты рапамицина зависели от генотипа: он значительно увеличил двигательную и исследовательскую активность и снизил тревожность крыс OXYS, но существенно повысил уровень тревожности крыс Вистар и не влиял на их локомоторную активность. МРТ-исследование показало, что рапамицин предупредил развитие признаков нейродегенерации: формирование очагов демиелинизации и расширение боковых желудочков. Таким образом, показано, что рапамицин обладает свойствами нейропротектора.

Рис.19. Влияние рапамицина на поведение крыс Вистар и OXYS в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт». Количество выходов в открытые рукава (А), время, проведенное в них (Б); количество вертикальных стоек (В) и актов груминга (Г). Данные представлены как M±SEM. # значимые межлинейные различия и * значимый эффект препарата.

Проект ФНМ-16. Взаимосвязь иммунных и метаболических нарушений в структуре психоэмоциональных расстройств: разработка инновационных подходов к лечению иммунодефицитных состояний (д.б.н. Н.Н. Кудрявцева)

Одной из задач этого года было подробно изучить особенности клеточного иммунитета у самцов с повторным опытом агрессии: широкий спектр субпопуляций лимфоцитов, их пролиферативную активность и энергетический метаболизм в тимусе и селезенке, уровень про- и противовоспалительных цитокинов в крови самцов со сформированной патологией агрессивного поведения, сопровождаемой активацией гуморального иммунитета. Исследовались самцы с повторным опытом агрессии в течение 20 дней. Измеряемые показатели у агрессивных самцов  сравнивались с показателями у интактных животных. Первичная обработка результатов показала, что количество ядросодержащих клеток крови, тимуса, селезенки и весовые индексы тимуса и селезенки у агрессоров с повторным опытом агрессии не отличались от контрольных животных, в отличие от самцов, находившихся под влиянием хронического социального стресса, у которых эти показатели были сниженными. Так же не отличался и субпопуляционный состав большинства лимфоцитов в тимусе, за исключением лимфоцитов CD4-25+, процент которых снижался под влиянием повторного опыта агрессии. В то же время в селезенке процентное соотношение субпопуляционного состава лимфоцитов резко отличалось от контроля: процент CD19+; CD(16/32)+; CD3+; CD3+4+8-; CD3+4-8+; CD4+25+; CD4+25hi+ был сниженным, а процент CD4-25+ существенно увеличивался. Исследование процентного соотношения клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла в селезенке, выявило у агрессивных животных повышение пролиферации клеток, что в совокупности с увеличением процента и абсолютного количества субпопуляции клеток CD4-25+ (клетки, экспрессирующие рецептор к ИЛ-2) и снижением процента CD4+25hi+ (Т-регуляторные супрессорные клетки) свидетельствует об активации клеточного пула спленоцитов. Процентное соотношение клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла в тимусе, отличалось от такового в селезенке. Данные нуждаются в тщательном анализе и готовятся к публикации.

Проект ФНМ-17. Участие биогенных аминов мозга в молекулярном механизме действия на центральную нервную систему новой группы биологически активных соединений – бензопентатиепинов (д.б.н. А.В. Куликов)

Синтезированный в НИОХ СО РАН гидрохлорид 8-(трифторметил) 1,2,3,4,5-бензопентатиепин-6-амина (ТХ-2153) обладает выраженной антидепрессантной и антикаталептической активностями без видимых побочных эффектов. В данном исследовании было установлено, что острое в/б введение препарата значительно повышает уровень серотонина (5-HT), его основного метаболита 5=-гидроксииндол уксусной кислоты (5-HIAA), дофамина (DA) и его метаболита гомованилиновой кислоты (HVA) в гипоталамусе мышей. Можно предположить участие серотониновой и дофаминовой систем гипоталамуса в механизме антикаталептического и антидепрессантного действия препарата.

Рис.20. Влияние 10, 20 или 40 мг/кг гидрохлорида 8-(трифторметил) 1,2,3,4,5-бензопента-тиепин-6-амина на концентрацию серотонина (5HT), 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5HIAA), дофамина (DA) и гомованилиновой кислоты (HVA) в гипоталамусе мышей C57BL/6. *p < 0,05, **p < 0,01 по сравнению с контролем (0).

Проект ФНМ-23. Полногеномный поиск SNPs, способствующих возникновению активирующих мутаций, для формирования новой группы маркеров предрасположенности к канцерогенезу (д.б.н. Т.И. Меркулова)

Из базы данных Cosmic было взято 2043 соматические мутации из 705 клеточных линий человека. Для 12 клеточных линий были найдены данные NGS, доступные для анализа, при этом достаточное количество данных для поиска SNP (покрытие района не менее ×20) было обнаружено только для клеточных линий A549, HCT-119, HL60. Для каждой из линий из этих данных NGS были выделены последовательности, картирующиеся в районы соматических мутаций, присутствующих хотя бы в одной клеточной линии. В результате в этих районах было найдено 50 SNP для A549, 1100 SNP для HCT-116 и 6 SNP для H60. При дальнейшем анализе было обнаружено, что район хромосомы 11 очень вариабелен в линии HCT-116 и поэтому в этой линии он был исключен из рассмотрения, после чего осталось 60 SNP для линии HCT-116. Обнаруженные SNP  были исследованы на сцепленность с соматическими мутациями путем сравнения зиготности аллелей, а также на частоту встречаемости в популяции. В результате не удалось обнаружить SNP с низкой частотой в популяции и с той же частотой аллеля, как и у соматической мутации.


Проект ФНМ-28. Фундаментальные эпидемиологические аспекты потенциальной мужской фертильности: значение для профилактической медицины и демографии (к.б.н. А.В. Осадчук)

Анализ кривых распределения продукции сперматозоидов выявил их экспоненциальный характер, свидетельствующий о том, что низкий уровень сперматогенеза представлен наибольшей частотой в исследованных популяциях (рис. 1). Эти данные указывают на значительный пул молодых мужчин с низкими показателями сперматогенеза, что говорит о существовании больших потенциальных рисков, связанных с воспроизводством населения. Причины такого явления могут заключаться не только в неблагоприятном действии многочисленных экологических факторов, но и в массовом отборе на снижение репродуктивного потенциала, вызванного социальным ограничением в размножении при формировании малодетной семьи за последние сто лет.

На выборке молодых мужчин г. Новосибирска установлено, что такие распространенные андрологические заболевания, как варикоцеле и простатит приводят к повышению риска субфертильности не только за счет снижения эффективности сперматогенеза, но и за счет нарушения упаковки хроматина и разрывов ДНК в сперматозоидах (рис. 21).

Рис. 21. Экспоненциальное распределение общего количества сперматозоидов в эякуляте у молодых мужчин г. Новосибирска и г. Минска.

Рис. 22. Показатели спермограммы и индекс фрагментации сперматозоидов у здоровых мужчин и больных варикоцеле и простатитом.

Проект ФНМ-29. Диагностика адаптивного потенциала человека: молекулярно-генетические и иммуногенетические механизмы адаптации к Северу у коренных этносов в сравнении с русскими жителями Сибири (к.б.н. Л.П. Осипова)

Впервые в популяции коренных представителей тундровых ненцев, проживающих в Ямало-Ненецком автономном округе, проведено исследование встречаемости полиморфных вариантов, являющихся факторами риска для развития ряда онкологических и других мультифакториальных заболеваний: A1405G (замена Ile105Val в молекуле белка), C2285T (замена Ala114Val) гена GSTP1 II фазы системы биотрансформации ксенобиотиков и A2455G (Ile462Val) гена CYP1A1 I фазы СБК. Впервые начато изучение рапространенности гаплотипов иммуноглобулинов класса G (система Gm). Мутантные варианты GSTP1 105Val и GSTP1 114Val в популяции тундровых ненцев встречаются с частотами 23,7 % и 4,8 % соответственно, их распространенность имеет как сходство, так и различия с европеоидными и монголоидными популяциями. Вероятно, это можно объяснить не только широкой вариабельностью распространения GSTP1-полиморфных вариантов в разных популяциях мира, но и особенностью происхождения и развития ненецкого этноса: малая численность тундровых ненцев могла способствовать дрейфу генов и последующему отбору в пользу наиболее «приспособленных» GSTP1-генотипов. Присутствие мутантного варианта CYP1A1 Ile462Val у тундровых ненцев может обусловить повышение риска развития некоторых онкологических и, возможно, других заболеваний, в патогенезе которых принимает участие цитохром Р450 1А1.


Фото. Дети, принимавшие участие в обследовании.

 

ПроектФНМ-30.Комплексное изучение наследуемых форм потери слуха в популяциях Сибири(к.б.н. О.Л. Посух)

Изолированная нейросенсорная тугоухость/глухота (НТ/Г) характеризуется высочайшей генетической гетерогенностью: уже картировано более 120 генетических локусов и идентифицировано около 70 генов, ассоциированных с НТ/Г (HereditaryHearinglossHomepage: http://hereditaryhearingloss.org). Наибольший патогенетический вклад в развитие НТ/Г во многих популяциях мира имеют мутации гена GJB2 (коннексин 26, Сх26), а информация о роли мутаций других «генов глухоты» имеется только для ограниченного числа популяций. Экстремальная генетическая гетерогенность наследуемой НТ/Г (проблема «много генов – один фенотип») значительно усложняет разработку универсальной молекулярной диагностики для этой патологии, поскольку последовательноесеквенирование по Сэнгеру всего множества генов, контролирующих НТ/Г, практически пока неосуществимо. В изолированных популяциях коренного населения Сибири, в семьях с глухотой неясной генетической этиологии, сохраняется возможность обнаружения новых генов, ответственных за потерю слуха. Впервые в России для поиска генов, ассоциированных с потерей слуха, был применен метод экзомногосеквенирования, что позволило выявить гены OTOF, RAI1, SCL26A4, мутации которых ответственны за потерю слуха в Cx26-негативных семьях с потенциально рецессивной потерей слуха неясной этиологии (Республика Алтай) (рис.).


Рис.23. Результаты экзомногосеквенирования в алтайских семьях с наследуемой потерей слуха неясной этиологии.

А –родословные семей 38, 40, 54. Черным цветом показаны глухие индивидуумы. Экзомноесеквенирование выполнено в образцах геномной ДНК индивидуумов с шифрами, выделенными голубым цветом.Б –результаты секвенирования по Сэнгеру, демонстрирующие мутации c.1111C>G (ген OTOF) и c.5254G>A (ген RAI1), обнаруженные в семьях 54 и 38, 40 соответственно. Все глухие потомки семьи 54 являются гомозиготами по мутации c.1111С>G (OTOF), а нормально слышащие члены этой семьи имеют генотип c.1111G>C/wt или wt/wt. Все глухие потомки в семьях 38 и 40 являются гомозиготами по мутации c.5254G>A (RAI1), а нормально слышащие члены этих семей – генотип c.5254G>A /wt или wt/wt. wt/wt – нормальный генотип.Родословная семьи 53 с глухотой, обусловленной мутациейc.2168A>G гена SLC26A4, не приведена.

Проект ФНМ-32. Высокоразрешающая диагностика структурных хромосомных аномалий человека (д.б.н. Н.Б. Рубцов)

В качестве метода получения микродиссекционных ДНК-библиотек, пригодных для проведения массового параллельного секвенирования, был опробован метод микродиссекции метафазных хромосом на стандартных цитологических препаратах c последующей амплификацией ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с частично вырожденным праймером MW6, разработанный ранее авторами проекта для создания ДНК-проб, пригодных для проведения обратного пэйнтинга (Rubtsov et al., 1996).  Была получена микродиссекционная ДНК-библиотека малой сверхчисленной маркерной хромосомы. Для контроля качества полученной микродиссекционной ДНК-библиотеки и первичного определения состава малой сверхчисленной маркерной хромосомы в дополнительных циклах ПЦР в присутствии Alexa488-dNTP была получена ДНК-проба и проведена супрессионная гибридизация in situ с метафазными хромосомами пациента (рис., а). Анализ сигнала флюоресцентной гибридизации in situ и инвертированного DAPI-бэндинга позволил описать аномальную хромосому как inv dup(15)(q13) (рис., б).

 

а)б)

Рис.24. Анализ малой сверхчисленной маркерной хромосомы супрессионной гибридизацией in situ микродиссекционной ДНК-пробой, полученной из маркерной хромосомы – супрессионная гибридизация in situ микродиссекционной ДНК-пробы с метафазными хромосомами пациента, синий – сигнал супрессионной гибридизации in situ, стрелка указывает на маркерную хромосому; схематическое изображение хромосомы 15 (слева) и сверхчисленной маркерной хромосомы (справа).

Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН А.II.6 «Молекулярная и клеточная биология» (координатор – акад. Г.П. Георгиев)

Проект 6.6. Системная биология: экспериментально-компьютерное исследование регуляции экспрессии генов про- и эукариот (акад. Н.А. Колчанов)

Был создан метод предсказания величин изменения сродства ТАТА-связывающего белка к ассоциированным с патологиями аллельным вариантам ТАТА-боксов промоторов генов человека. Была впервые экспериментально доказана достоверность его оценок как для абсолютных, так и для относительных величин ТВР/ТАТА-сродства.

Впервые на примере 27 ассоциированных с 10 патологиями аллельных вариантов ТАТА-бокса генов человека (талассемия, боковой амиотрофический склероз, иммуносупрессия, рак легких, тромбофлебит и др.) была проведена компьютерно-экспериментальная проверка эмпирического уравнения констант равновесия скольжения ТВР вдоль ДНК до остановки на ТАТА-боксе и стабилизации ТВР/ТАТА-комплекса изгибом спирали ДНК. Она установила значимые корреляции между предсказанными и измеренными оценками ТВР/ТАТА-сродства, абсолютными (r = 0,82, α < 10–7) и относительными (r = 0,79, α < 10–3).


Рис.25. Сравнение экспериментально определенного и теоретически предсказанного сродства TBP к TATA боксу.

Проект 6.7. Серотониновые рецепторы мозга в молекулярно-генетических механизмах патологического поведения: взаимодействие с дофаминовой системой (д.м.н. Н.К. Попова)

Нокаут гена Kaiso существенно влияет на поведение мышей, делает их гиперактивными и не способными обучаться пространственной навигации. Эти нарушения поведения, по-видимому, обусловлены нарушениями морфологии и функции головного мозга.

Ген Kaiso кодирует одноименный белок, участвующий в эпигенетической регуляции транскрипции генов. Этот белок связывается с метилированными цитозинами в промоторах и подавляет экспрессию генов. Сотрудниками центра «Биоинженерия» СО РАН на базе генома линии C57BL/6 (B6) был проведен полный нокаут гена Kaiso и создана трансгенная линия C57BL/6/Kaiso (B6-102), которая поддерживается в Российском национальном центре генетических ресурсов лабораторных животных на базе SPF-вивария Института цитологии и генетики СО РАН. В работе исследовалось влияние нокаута гена Kaiso на поведение, морфологию головного мозга и экспрессию генов, кодирующих фермент метаболизма дофамина – катехол-о-метилтрансферазу (Comt), D1 (D1r) и D2 (D2r) рецепторы дофамина в головном мозге.


Рис.26. Сравнение двигательной активности в тесте открытого поля (А), динамики уменьшения пути поиска скрытой платформы в водном лабиринте Морриса (Б) и томографическое изображение боковых желудочков мозга (В) у мышей B6 и B6-102. Двигательная активность измеряется величиной пути (см), пройденного в открытом поле за 5 мин теста. Способность к обучению измеряли по динамике уменьшения пути (см), пройденного до скрытой платформы, в водном лабиринте Морриса в течении четырех последовательных дней (* p < 0,05, *** p < 0,001 vs B6, ### p < 0,001 vs первый день обучения).

Проект 6.14. Особенности организации и регуляции экспрессии гомеологичных генов, определяющих развитие пшеницы (д.б.н. Е.А. Салина)

Яровой/озимый тип развития мягкой пшеницы определяется присутствием доминантных/рецессивных гомеологичных генов VRN-А1, VRN-B1, VRN-D1, локализованных на хромосомах 5А, 5B и 5D соответственно. Проведен сравнительный анализ первичной структуры двух аллелей гена VRN-B1 мягкой пшеницы: VRN-B1а из сорта Диамант 2 и VRN-B1с из сорта Саратовская 29. Последний аллель обусловливает более раннее (на 7–14 дней) наступление фазы колошения, по сравнению с аллелем VRN-B1а. В составе первого интрона аллеля VRN-B1с были выявлены значительные структурные изменения, по сравнению с аллелем VRN-B1a: делеция 0,8 т.п.н. и дупликация близлежащего района 0,4 т.п.н. Данная структура аллеля гена ярового типа развития описана впервые. Нами также было показано, что транскрипция аллеля VRN-B1с происходит значительно более активно, чем аллеля VRN-B1а (рис.). Таким образом, есть все основания предполагать, что выявленные изменения в первом интроне VRN-B1 гена предопределяют более раннюю индукцию транскрипции и более раннее наступление фазы колошения у линии мягкой пшеницы – носителя аллеля VRN-B1с. Изучение структуры и экспрессии генов VRN лежит в основе создания селекционных линий пшеницы с заданными сроками созревания. Маркеры, разработанные к изучаемым генам в ходе выполнения проекта, используются при проведении маркер-контролируемой селекции пшеницы

 

а)б)

Рис.27. Анализ экспрессии доминантных и рецессивных аллелей гена VrnB1 методами ОТ-ПЦР (а) и ПЦР в режиме реального времени (б).
Bz1 – озимый сорт пшеницы Безостая 1; iBz/Vrn-B1c – яровая линия Безостой 1 с геном Vrn-B1c; iBz/Vrn-B1a –яровая линия Безостой 1 с геном Vrn-B1а.

Проект 6.17. Молекулярно-генетические механизмы прямых и коррелированных ответов на отбор по поведению и стресс-реактивности: экспериментальное исследование на моделях доместикации и крысах линий НИСАГ, ГК и МД (д.б.н. А.Л. Маркель)

Результаты анализа экспрессии мРНК генов в ткани почки показали, что значительная часть дифференциально экспрессирующихся генов в почках гипертензивных крыс НИСАГ (по сравнению с нормотензивными крысами) связана с ответом на стресс и регуляцией натриевого баланса. Это прежде всего касается генов катехол-О-метилтрансферазы (Comt) и рецепторов норадреналина (α1A-AR), генов минералокортикоидного рецептора (Mlr) и эпителиального натриевого канала (b-ENaC, α-ENaC) и гена 11-бета-гидростероид дегидрогеназы-2 (11-βHSD-2). Отмеченное изменение экспрессии генов Comt и α1A-AR приводит к усилению симпатической стимуляции почки, а генов Mlr, b-ENaC, α-ENaC и 11-βHSD-2 – к усилению задержки натрия в организме. Наряду с этим изменяется экспрессия генов Egfr и Ephx2, которые участвуют в регуляции почечной гемодинамики. Такое изменение транскриптома в почке гипертензивных крыс НИСАГ является основным фактором формирования стойкой артериальной гипертонии.


Рис.28. Схема нефрона с указанием дифференциально экспрессирующихся генов, участвующих в регуляции почечных функций и артериального давления у гипертензивных крыс линии НИСАГ.

Проект 6.18. Влияние структуры 5′-нетранслируемого района на эффективность трансляции эукариотических мРНК в норме и в условиях стресса (к.б.н. А.В. Кочетов)

Найдено, что характеристики лидерных открытых рамок считывания, расположенных в 5′-НТП мРНК генов Saccharomyces cerevisiae и начинающихся с неканонических стартовых кодонов, свидетельствуют о функциональной значимости кодируемых ими полипептидов. Показано, что распознавание неканонических стартовых кодонов может усиливаться элементами вторичной и третичной структур РНК. Также был проведен сравнительный анализ мРНК млекопитающих с оптимальным и субоптимальным вариантами контекста стартового кодона: найдено, что предсказанная третичная структура в начале белок-кодирующей последовательности значительно стабильнее во втором случае. Таким образом, формирование структурных особенностей мРНК, определяющих эффективность распознавания «слабых» стартовых кодонов, могло в ходе эволюции осуществляться не только на уровне локальных стебле-петлевых структур.


Рис.29. Распознавание неканонических стартовых кодонов в мРНК генов дрожжей и млекопитающих.

Проект 6.19. Молекулярные и эпигенетические механизмы процесса инактивации Х-хромосомы и репрограммирования соматических клеток к плюрипотентному состоянию  (д.б.н. С.М. Закиян)

Показано, что механизмы и динамика процесса импринтированной инактивации Х-хромосомы в предимплантационном развитии у грызунов имеют значительные видоспецифические отличия.

Обнаружены существенные отличия в составе и картине распределения репрессивных модификаций хроматина в процессе импринтированной инактивации Х-хромосомы у полевки и мыши. Эти данные свидетельствуют о значительном разнообразии механизмов регуляции процесса импринтированной инактивации и о различных потребностях в дозовой компенсации генов Х-хромосомы на ранних стадиях эмбрионального развития у грызунов.

Рис.30. Видоспецифические особенности хроматина неактивной Х-хромосомы при импринтированной инактивации на предимплантационных стадиях развития у полевки M. levis. Иммунофлюоресцентное окрашивание модификаций неактивного хроматина (H3K9me3 – зеленый цвет и H3K27me3 – серый цвет) совместно с РНК FISH (Xist РНК – красный цвет) на стадии бластоцисты.

Проект 6.20. Анализ функции белков семейства Bcl-2, защищающих клетки мозга от гибели, в механизмах устойчивости к индуцируемой стрессом психопатологии (чл.-корр. РАН Н.Н. Дыгало)

Обнаружено, что глюкокортикоиды активируют пирамидные нейроны СА1 поля неонатального гиппокампа и индуцируют гибель клеток субикулюма, иннервируемого этими нейронами (рис.31). Опосредованный возбуждением глутаматергических нейронов непрямой путь глюкокортикоидной «эксайтоттоксичности» способен вызвать нарушение формирования головного мозга при неонатальном (родовом) стрессе и глюкокортикоидной терапии респираторного дистресс-синдрома новорожденных и тем самым явиться причиной психопатологии «онтогенетического» генеза в последующие периоды жизни.


Рис.31. Экспрессия активной каспазы-3 – ключевого маркера апоптоза и его основной исполнительной протеазы в мозге, в субикулюме 3-дневных крысят через 6 ч после введения дексаметазона. Линейка = 100 мкм. А – репрезентативные микрофотографии передней части головного мозга крысят. На выносках отмеченные прямоугольниками увеличенные области субикулюма. Головками стрелок указаны клетки, позитивные по активной каспазе-3. В – количественная оценка числа позитивных по активной каспазе-3 клеток. Данные представлены как М ± m. INT – контроль; DEX – дексаметазон. * p < 0,01 по сравнению с контролем.

Проект 6.22.Генетический полиморфизм ферментов системы свертывания крови у тундровых ненцев и их метисов в связи с типом питания и проживанием в условиях Севера с целью выработки подходов к диагностике тромбозо-зависимых заболеваний.(к.б.н. Л.П. Осипова)

В 2013 г. проведено исследование распределения мутаций в генах факторов свертывания крови FII (G20210A) и FV (G1691A, мутация Leiden), ответственных за развитие тромбозов, среди жителей Севера (коренных тундровых ненцев и этнически чистых русских).

Согласно полученным результатам, можно предположить, что у тундровых ненцев, по сравнению с русскими Севера, отмечена тенденция к снижению популяционного риска развития тромбозов и других связанных с ними осложнений, причинами которых может являться носительство изученных мутантных вариантов FII (G20210A) и FV (G1691A, мутация Leiden).

Генотипирование однонуклеотидных замен в генах факторов FII и FV проводили методом real-timePCR с использованием конкурирующих TaqMan-зондов.

Частоты мутаций G1691Aи G20210A в изученных популяциях

Популяция

Число обследованных аллелей

Частота G1691A, %

Число обследованных аллелей

Частота G20210A, %

Тундровыененцы

516

0,4

532

0

Русские

602

2,5*

608

0,66

* Частота мутации 1691A среди русских статистически значимо отличается от таковых частот для тундровых ненцев (р=0,003).

Частоты встречаемости полиморфных вариантов G1691A и G20210A, наличие которых может повышать риск развития тромбозов и связанных с ними заболеваний, среди русских ЯНАО сравнимы с таковыми в популяциях других европеоидов и очень низки в популяциях ненцев, что может объясняться разным происхождением популяций и направлением действия естественного отбора. Также вероятно, что это является одним из механизмов адаптации коренных ненцев к условиям высоких северных широт и особому «полярно-метаболическому» типу питания с преобладанием в пище белков и жиров. Такой тип питания среди европеоидов являлся бы риском развития атеросклероза и других сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), у ненцев же (и других коренных народов Севера) по сравнению с русскими и другими европеоидами гораздо реже встречаются сердечно-сосудистые заболевания (инфаркты, инсульты). На основании результатов нашего исследования можно предположить, что редкие частоты встречаемости мутаций в генах факторов системы свертывания крови у ненцев могут быть в числе причин низкой частоты встречаемости ССЗ в этих популяциях.

Проект 6.24. Функциональные особенности дуплицированных копий генов у злаковых растений (д.б.н. Е.К. Хлёсткина)

Дупликация гена, предшествующая возникновению гена с новой функцией, считается одной из основных направляющих сил эволюции. Цель настоящего проекта состоит в выявлении особенностей эволюции и функциональной организации дуплицированных копий генов злаковых растений. На данном этапе работы проводились идентификация, выделение и сравнительный анализ структурно-функциональной организации дуплицированного гена F3h у представителей трибы Triticeae. Данный ген кодирует один из ключевых ферментов биосинтеза защитных соединений, флавоноидов, – флаванон-3-гидроксилазу. У большинства видов растений F3h присутствует в виде единичной копии. Однако в геноме некоторых злаков трибы Triticeae выявлена дупликация этого гена. А именно: в геноме R ржи посевной, в геномах B и G различных полиплоидных видов пшеницы и у предка геномов B и G Aegilopsspeltoides Tausch. Установлено, что у растений, имеющих один из данных геномов, дуплицированный ген F3h специфически транскрибируется в корнях и неактивен в перикарпе зерновки, стебле, колеоптиле и листе, где экспрессируется основной ген F3h, который наоборот неактивен в корнях. Дупликация кодирует функциональный фермент F3H, отличающийся от типичного F3H единичными заменами аминокислот в области связывания фермента с субстратом.


Проект 6.25. Молекулярные механизмы формирования психоэмоциональных расстройств(д.б.н. Н.Н. Кудрявцева)

Повторный опыт агрессии сопровождается развитием психопатологии агрессивного поведения у самцов мышей, которая изменяет активность многих нейромедиаторных систем мозга на уровне метаболизма, рецепции и экспрессии генов. Целью данного исследования было изучить возможное изменение нейрогенеза в гиппокампе, ответственном за когнитивные процессы, и состояние нейрональной активности в миндалине, ответственной за эмоциональное сопровождение любого мотивационного поведения. Показано, что у самцов мышей с повторным опытом агрессии в течение 20 дней происходит существенное увеличение числа BrdU-позитивных  клеток в субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампа, что свидетельствует об увеличении нейрогенеза в этой зоне. После прекращения конфронтаций на период 14 дней число клеток все еще остается на повышенном уровне.  В то же время нейрональная активность в базолатеральной части миндалины, оцениваемая по числуC-fos-позитивных  клеток, существенно снижается под влиянием повторного опыта агрессии, при этом пониженный уровень длительно сохраняется.Большой массив новых данных находится в обработке.

Рис. 32. Число BrdU-позитивных клеток в субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампау контрольных животных и у самцов с повторным опытом агрессии в течение 20 дней до (агрессоры, левый столбик) после прекращения конфронтаций (агрессоры, правый столбик). * P< 0,05vsконтроль.
 
Рис. 33. Число C-fos-позитивных клеток в базолатеральной части миндалины у контрольных животных и у самцов с повторным опытом агрессии в течение 20 дней до (агрессоры, левый столбик) и после прекращения конфронтаций (агрессоры, правый столбик). * P< 0,05vsконтроль.
 

Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Живая природа: современное состояние и проблемы развития» (координатор – акад. Д.С.Павлов)

Подпрограмма 1: Биоразнообразие: состояние и динамика (координатор чл.-корр. РАН В.П. Седельников)

Проект 30.1.Сохранение биоразнообразия млекопитающих путем создания криобанка эмбрионов и межвидовой эмбриотрансплантации на примере хомячков рода Phodopus(д.б.н. С.Я. Амстиславский)

Преимплантационные эмбрионы хомячка Кэмпбелла были заморожены, криоконсервированы и разморожены тремя различными способами. Жизнеспособность эмбрионов в контроле (свежие) и после размораживания оценивали при помощи световой и флюоресцентной микроскопии.

Наиболее эффективным оказался способ CRYO-3 (замораживание по классической программе с использованием этиленгликоля и сахарозы в качестве криопротектора и медленном размораживании). Каждый эксперимент имел три повтора, общее число эмбрионов в группах – не менее 10.

Рис. 34. Результаты криоконсервации эмбрионов хомячка Кэмпбелла,флюоресцентная микроскопия (FDA+PI). Зеленая флуоресценция после добавления диацетатафлюоресцеина свидетельствует о том, что бластомеры живые.

Дополнительно были проведены эксперименты по культивированию эмбрионов хомячка Кэмпбелла после замораживания и размораживания и исследование развития в культуре со стадии дробящегося зародыша до бластоцисты.

Впервые в мировой практике было продемонстрировано успешное замораживание, криоконсервация и культивирование invitro хомячков рода Phodopus.

Рис.35. Культивирование эмбрионов хомячка Кэмпбелла.
а – сразу после размораживания;
б – 24 ч после культивирования invitro;
в – 48 ч после культивирования invitro.
Дополнительно были проведены эксперименты по культивированию эмбрионов хомячка Кэмпбелла после замораживания и размораживания и исследование развития в культуре со стадии дробящегося зародыша до бластоцисты.

Впервые в мировой практике было продемонстрировано успешное замораживание, криоконсервация и культивирование invitro хомячков рода Phodopus.

Подпрограмма 3. Динамика и сохранение генофондов (координатор акад. В.К. Шумный)

Проект 30.26.Разработка методов поиска ключевых генов – мишеней для селекции и трансгенеза (д.б.н. Т.И. Аксенович)

Недавно при анализе ассоциаций было предложено рассматривать не отдельные SNP, а целые регионы, соответствующие определенным генам или включающие участники определенного метаболического пути. Такой подход позволяет значительно увеличить статистическую мощность, особенно в случае редких генетических вариантов. Обычно для характеристики региона используют различные варианты метода коллапса. Альтернативой этому являются методы ядерного сглаживания, суммирующие взвешенные различия генотипов отдельных SNP у каждой пары особей. Однако подавляющее большинство методов и программ для регионального анализа ассоциаций, использующих ядерное сглаживание, применимо только к независимым выборкам. Выборки лабораторных и сельскохозяйственных животных, как правило, состоят из родственных особей и требуют создания специальных методов, учитывающих это родство.

Мы разработали такой метод регионального анализа ассоциаций, который позволяет работать с родственными выборками. В его основе лежит предложенная нами трансформация количественных признаков у родственных особей, позволяющая проводить региональный анализ ассоциаций с помощью пакетов программ, разработанных для независимых выборок. Трансформация количественного признака была получена в результате аналитического преобразования скор-теста, по величине которого судят о наличии ассоциации между фенотипом и генотипом.

Мы изучили статистические свойства предложенного метода, используя находящиеся в открытом доступе генотипы миниэкзома (10,703 SNPs в 1,702 генах) и симулированные количественные признаки (3 признака по 200 повторов) у 697 родственных особей(GAW17). Анализ показал, что только у нашего метода ошибка первого рода совпала с декларируемым значением. Использование нетрансформированных количественных признаков приводит к существенному завышению ошибки первого рода, тогда как полная элиминация внутрисемейных корреляций из фенотипических данных значительно занижает эту ошибку (рис.36).

Рис.36. Ошибка I рода для трех трансформаций трех количественных признаков (Q1, Q2 и Q3) при декларируемом значении ошибки 0,05. Различные весовые функции, обозначенные какw1, w2 и w3, соответствуют параметрам бета-функции (0,5, 0,5), (1, 1) и (1, 25).

Таким образом, разработанный нами метод дает несмещенную оценку ошибки первого рода. Тем не менее он является аппроксимационным и, следовательно, может быть рекомендован к широкому использованию для предварительной отбраковки большей части регионов, не участвующих в контроле признака. Для более корректного анализа значимых сигналов требуются разработка точных методов регионального анализа ассоциаций и реализация их в виде пакетов компьютерных программ.

Проект 30.27. Идентификация пластидных генов, ответственных за создание репродуктивных барьеров вследствие конфликта ядра и цитоплазмы в роде горох (Pisum L.) (к.б.н. В.С. Богданова)

Отработана методика выделения хлоропластов и хлоропластной ДНК с целью дальнейшего секвенированияпластидных геномов гороха. С использованием высокопроизводительного секвенирования на платформе IonTorrentбыли получены нуклеотидные последовательности пластидных геномов двух линий гороха: культурной (WL1238) и дикой (VIR320), относящейся к подвиду Pisumsativumsubsp. elatius.Биоинформатическая обработка полученных данных с использованием высокопроизводительного вычислительного оборудования позволила полностью собрать пластидный геном линии WL1238.

Были проаннотированы различия последовательности пластидного генома линии WL1238 по сравнению с пластидным геномом сорта FelthamFirst, опубликованным в публичных базах данным под номером NC_014057. Длина пластидного генома WL1238 составила 122156 п.о., что на 13 п.о. короче последовательности NC_014057, что может быть связано, в том числе, с особенностями метода секвенирования, который дает систематическое укорочение длинных (>11 п.о.) гомополимерных трактов. Всего отмечено 302 различия в первичной структуре в форме коротких (1–3 п.о.) делеций, инсерций, нуклеотидных замен. Кроме того, у WL1238 выявлена делеция, которой в пластидном геноме FelthmanFirst соответствуют два совершенных тандемных повтора фрагмента 27 п.о. (всего 54 п.о.), Также у WL1238 выявлена инсерция 45 п.о. Указанные делеция и инсерция затрагивают один и тот же ген, psaA, и приводят к делеции 18 и инсерции 15 аминокислот. Длина пластидного генома дикой линии VIR320 составила около 121785 п.о., что короче пластидного генома культурного гороха почти на 360 н.п. за счет делеции длиной 240 п.о. в межгенном промежутке ndhD-trnI и небольших (3–5 п.о.) делеций, распределенных по геному.Показано удлинение пластидного генома культурного гороха по сравнению с исследованным образцом дикого гороха.

Проект 30.29. Полиморфизм генов терморецепторов в этнических группах Сибири и Крайнего Севера(чл.-корр. РАМН М.И. Воевода)

Исследование генетической вариабельности гена холодового рецептора TRPM8 по шести однонуклеотидным полиморфизмам (ОНП) в популяциях человека Центральной и Северной Евразии выявило резкие различия по частоте отдельных гаплотипов и даже групп гаплотипов между русскими, казахами и чукчами. Ген кодирует белок, который реагирует на изменение температуры в диапазоне от 8°С до 28°С. Композиция и локализация исследованных ОНП в гене являются уникальными. Генотипирование образцов ДНК по шести ОНП и последующий анализ генотипов позволил выявить 21 гаплотип, встречающийся с разными частотами в трех популяциях. Особенности распределения различных паттернов гаплотипов и их коэффициенты гетерогенности (Fst) между популяциями свидетельствуют об избирательной селекции определенных вариантов гена TRPM8 у русских, казахов и чукчей в ходе расселения современного человека в Евразии.


Рис.37. Избирательное распределение гаплотипов по шести однонуклеотидным полиморфизмам гена холодового рецептора TRPM8 в трех географически отдаленных популяциях Северной Евразии.

Проект 30.30. Создание фен- и генколлекций тетраплоидных пшениц и их использование в селекционно-генетических исследованиях (чл.-корр. РАСХН Н.П. Гончаров)

Изучен ген, являющийся транскрипционным фактором и играющий основную роль в процессе изменения фенотипа растений (яровой–озимый). Для поиска нарушений в районе интронаVrn-А1 было проведено два варианта ПЦР амплификации. В 1-м варианте праймеры были подобраны таким образом, чтобы делетированный вариант гена Vrn-1 по типу делецииLandgon приводил к получению ПЦР фрагмента, в то время как ненарушенные последовательности гена Vrn-1 не приводили к получению данного фрагмента ДНК (рис., а). Во втором варианте наоборот наличие ненарушенных генов позволяло получить ПЦР продукт, а присутствие делеции приводило к отрицательным результатам ПЦР амплификации (рис., б).


Рис.38 Результат ПЦР амплификации со специфическими парами праймеров, позволяющими выявлять наличие делеции в критическом районе первого интрона (Int1) гена Vrn-A1 в виде присутствия (а) ПЦР – фрагмента или его отсутствия (б). Номера исследуемых видов: 1 – положительный контроль (TDD); 2–17 –номера образцов d11-d26 T.dicoсcoides в таблице, 18 – отрицательный контроль.

Анализ результатов ПЦР амплификации и полученных нуклеотидных последовательностей района 1-го интрона гена Vrn-1 позволил установить, что у возделываемых видов пшениц ранее выявленное нарушение в данных последовательностях привело к возникновению яровости только у одного из 23 исследованных яровых образцов дикого предка полиплоидных пшениц T.dicoсcoides различного происхождения.

Проект 30.32. Изучение кэпингателомер в клетках бурозубок (д.б.н. Н.С. Жданова)

В первичных фибробластах S. granarius выявлена высокая частота дисфункциональных теломер, характеризующаяся накоплением в них гистона γ-H2AX (DDR+ теломер). Характер DDR+ теломер в хромосомах S. granarius оказался схож с наблюдаемым в ALT клетках человека, использующих гомологичную рекомбинацию для поддержания длины теломер. Это свойство теломерS. granarius не характерно для вида близнеца S. araneus


Рис.39 Дисфункциональные теломеры в первичных фибробластах Sorexgranarius.

Слева метафазная пластинка и профили интенсивностей. Зеленый цвет – маркер DDR+ теломер – гистон g-H2AX, иммуноокрашивание антителами, конъюгированными с FITC. Красный цвет – окраска теломерной ДНК с PNAтеломерной пробой, коньюшированной с Cy3, FISH. Синий цвет – окраска хромосом DAPI. Справа примеры DDR+ теломер.

Проект 30.33. Генетическая изменчивость видов и адаптация (д.б.н. И.К. Захаров)

Получены данные о наличие ответа обоих партнеров симбиотической ассоциации «WolbachiaDrosophila melanogaster» на тепловое воздействие. Положительное влияние присутствия Wolbachia на продолжительность жизни и выживаемость мух при температурном стрессе указывает на наличие компенсаторных адаптивных механизмов взаимодействия симбионтов вследствие сложившегося в процессе эволюции тесного контакта эндосимбиотической бактерии с внутриклеточными органеллами хозяина.

 

Рис. 40 Положительное влияние присутствия Wolbachia на продолжительность жизни мух при температурном стрессе.

W+ – инфицированные Wolbachia линии; W- – неинфицированные Wolbachia линии.

Проект 30.34. Реконструкция генных сетей стрессового ответа у растений (к.б.н. А.В. Кочетов)

Проведено исследование линий трансгенных растений Nicotiana tabacum, несущих дцРНК-супрессор гена экстраклеточной S-подобной рибонуклеазы Nk1, на устойчивость к Phytophthora parasitica var. nicotianae. Согласно предварительным данным, супрессия апопластной рибонуклеазы приводит к снижению устойчивости растений к фитопатогенным оомицетам, что говорит о защитной функции S-подобных рибонуклеаз в этой системе. Степень поражения определяли у растений с супрессированной активностью гена Nk1 в сравнении с нетрансгенным контролем. Оценку проводили на отделенных листьях и оценивали по стандартной 10-балльной шкале (0 баллов – лист погибал полностью, 10 баллов – отсутствие признаков развития инфекции). Согласно полученным предварительным результатам, трансгенные растения менее устойчивы к фитофторе (табл.). Таким образом, супрессия апопластной рибонуклеазы приводит к снижению устойчивости растений к фитопатогенным оомицетам, что говорит о возможной защитной функции экстраклеточных рибонуклеаз в этой системе.

Таблица 3. Средний балл устойчивости к фитофторе листьев растений с супрессированным геном S-подобной рибонуклеазы Nk1 в сравнении с контролем

Растения

Средний балл устойчивости

SR1 (контроль)

5

Nk-11

3.6

Nk-17

3.0



Проект 30.35. Создание и поддержание селекционных моделей доместикации и некоторых патологических состояний для изучения их генетических и эпигенетических механизмов (д.б.н. А.Л. Маркель)

Ранее нами был идентифицирован локус (QTL) на 12-й хромосоме лисиц, вовлекаемый в регуляцию ручного поведения. С помощью технологии секвенирования второго поколения были секвенированы геномы 20 ручных и 20 агрессивных лисиц. Для выявления SNP проведен сравнительный анализ всех нуклеотидных последовательностей, которые использовались для сборки транскриптома, в результате было обнаружено 22785 SNP и были определены относительные позиции SNP в геноме лисы. Набор из 5700 SNP, каждый из которых присутствовал у каждой из 40 лисиц, был проанализирован методом главных компонент (рис. 41).

Главная компонента-1 (PC-1) демонстрирует генетическое расхождение между популяциями, а PC-2 указывает на наличие генетических различий внутри выборки агрессивных лисиц. Сравнение аллельных частот SNP в ручной и агрессивной популяции выявило 386 SNP, показывающих значительные различия в частоте встречаемости между двумя популяциями (p < 1 × 10–5). 6 из этих SNP локализованы в том же регионе 12-й хромосомы, где ранее нами был идентифицирован QTL, вовлекаемый в регуляцию ручного поведения (рис. 42).




ручные
агрессивные

 

Рис. 41 Данные по SNP 20 ручных и 20 агрессивных лисиц, обработанные методом главных компонент. В анализ была включена информация о 5700 SNP, представленных у всех 40 особей.



Рис. 42 SNP, аллели которых различаются по частоте встречаемости в ручной и агрессивной популяциях. На рисунке представлена хромосома 12 лисицы.

Ось абсцисс отражает расположение SNP в геноме лисицы, основанное на экстраполяции данных по геномной последовательности собаки. Черными точками показаны SNP, аллели которых различаются по частоте в ручной и агрессивной популяциях. На оси ординат отмечено граничное значение (-log(p)10) для различий в частоте SNP (серая линия). Зеленая линия показывает QTL на 12-й хромосоме, вовлеченный в формирование доместикационного поведения; горизонтальная зеленая линия на оси ординат – граничное значение уровня значимости для этого QTL (p < 0,01). На оси абсцисс также отражено, какие хромосомы собаки соответствуют 12-й хромосоме лисицы, и их взаимное расположение: фиолетовая линия – 11-я хромосома, оранжевая – 35-я, коричневая – 5-я. Голубые вертикальные линии показывают расположение микросателлитных маркеров лисицы, ассоциированных с доместикационным поведением.

Проект 30.36. Разработка и использование технологии ускоренного создания генотипов мягкой пшеницы, несущих пирамиды генов, ответственных за устойчивость к стрессовым факторам (д.б.н. Л.А. Першина)

В результате проведенной работы выявлена неодинаковая реакция изученных генотипов на условия культивирования и зависимость показателей андрогенеза от влияния пшенично-чужеродных транслокаций и генотипической среды мягкой пшеницы. Для повышения эффективности каждого из этапов андрогенеза – образования андрогенных эмбриоидов, регенерации зеленых проростков, спонтанного развития фертильных дигаплоидов(для мягкой пшеницы – это тригаплоиды (n=3x=21), спонтанно удвоившие число хромосом (2n=6x=42)) – были  оптимизированы условия выращивания растений-доноров, состав инициальной культуральной среды (за счет изменения концентрации 2.4-Д), а также условия культивирования пыльников (температурный режим предкультивирования и культивирования) и андрогенных эмбриоидов (температурный режим и продолжительность светового дня). На основе андрогенных растений с восстановленной фертильностью получен набор гомозиготных линий мягкой пшеницы с пшенично-чужеродными транслокациями, носителями генов, определяющих устойчивость к грибным патогенам.



Рис.43 Результаты культивирования пыльников  формы яровой мягкой пшеницы Л-311/00-22: а – развитие андрогенных эмбриоидов на инициальной среде P-II; б – развитие проростков из андрогенных эмбриоидов на безгормональной среде B-5; в – колос фертильного андрогенного растения (2n=42); г – колос стерильного тригаплоида (n=21).

Проект 30.37.Взаимодействие октопаминового и инсулинового сигнальных путей в контроле репродуктивной функции насекомых (модель Drosophila) (д.б.н. И.Ю. Раушенбах)

Впервые продемонстрировано, что инсулин вызывает у самок D. melanogaster: снижение уровня деградации ЮГ (рис.44) и стресс-реактивности системы метаболизма ЮГ, что свидетельствует о повышении синтеза гормона; повышение синтеза ОА, поскольку активность ТДК повышена (рис.44), а активность OANAT не изменяется. Важно отметить, что повышение активности ТДК у самок, обработанных инсулином, свидетельствует, по-видимому, о том, что инсулин повышает синтез 20-гидроксиэкдизона (20Э). Предположение поддерживается тем, что (1) повышение уровня ЮГ у самок дрозофилы вызывает снижение, а повышение 20Э – повышение активности ТДК; (2) мутация гена InR снижает синтез 20Э.

Впервые получено свидетельство взаимодействия октопаминового и инсулинового сигнальных путей в контроле приспособленности (репродуктивной функции и стрессоустойчивости) насекомых.

Рис.44 Влияние инъекции инсулина на активность ТДК и деградацию ЮГ в норме и при тепловом стрессе.

*Достоверность различий между особями каждой группы в нормальных и стрессирующих условиях;♦ – достоверность отличий от самок, обработанных инсулином. ФСБ – фосфатно-солевой буфер.

Проект 30.38. Унипарентные геномы как модули для оценки динамики генофондов природных популяций(д.б.н. Н.Б. Рубцов)

В 2013 г. проведены сбор материала и его молекулярно-цитогенетический анализ: полученысуспензии фиксированных клеток, препараты метафазных хромосом, микродиссекционные ДНК-библиотеки С-положительныхприцентромерных районов хромосом. Для оценки распределения повторенных последовательностей ДНК были проведены эксперименты по гибридизации insitu ДНК С-положительных прицентромерных районов хромосом с метафазными хромосомами мышей родов Sylvaemus (S. uralensis, S. ponticus, S. flavicollis, S. fulvipectus и S. sylvaticus.) и Apodemus (A. peninsulae, A. argenteus,A. speciosus,A. agrarius).Ранее с использованием кросс-гибридизации ДНК-проб, полученных из прицентромерных С-сегментов особей видов рода Sylvaemus, c хромосомами представителей исходных видов и видов рода Apodemus, а также ДНК-проб, полученных из прицентромерных С-блоков особей видов Apodemus, с хромосомами экземпляров вовлеченных в исследование видов родов Apodemus и Sylvaemus было показано, что (i) прицентромерные районы хромосом особей, относящихся к одному виду, но разным хромосомным расам отличаются по числу гомологичных повторенных последовательностей, (ii) прицентромерные районы хромосом особей, относящихся к близкородственным видам, содержат гомологичные последовательности в части хромосом, (iii) число хромосом, содержащих в прицентромерных районах гомологичные повторенные последовательности, уменьшается с увеличением времени дивергенции сравниваемых видов.

Анализ результатов кросс-гибридизации микродиссекционных ДНК-проб выявил более высокую концентрацию повторенных последовательностей, гомологичных ДНК С-положительных прицентромерных районов хромосом, в эухроматиновых районах половых хромосом относительно эухроматиновых районов аутосом. Полученные данные указывают на существование отличий в эволюции ДНК половых хромосом и аутосом.

Для более детального анализа особенностей эволюции половых хромосом в проекте планируется проведение секвенирования микродиссекционных ДНК-библиотек. Отработка метода массового параллельного секвенирования ДНК микродиссекционных ДНК-библиотек была проведена на модели сверхчисленной маркерной хромосомы человека invdup(15). В результате использования стандартного метода (микродиссекция, получение микродиссекционной ДНК-пробы, обратная FISH) сверхчисленнаямаркерная хромосома человека была описана как invdup(15)(q13). В ходе эксперимента была проведена оценка эффективности получения микродиссекционных ДНК-библиотек и их секвенирования для хромосомы 15 человека (рис.45).

Рис.45 Анализ результатов секвенирования ДНК-библиотек HSA15 и invdup(15)(q13.3). Локализация фрагментов ДНК из ДНК-библиотек q-плеча хромосомы 15 (зеленый цвет) и сверхчисленной маркерной хромосомы (красный цвет) в q-плече хромосомы 15 человека. На оси Х показано положение последовательностей, соответствующих фрагментам ДНК микродиссекционных ДНК-библиотек на части q-плеча хромосомы 15; на оси Y – число соответствующих фрагментов. Трек был построен с помощью ucsc браузера (www.genome.ucsc.edu).

 

Проект 30.39. Поиск и перенос новых генов устойчивости к грибным болезням в яровые и озимые генотипы пшеницы (д.б.н. Е.А. Салина)

Выявлены и проведено уточнение локализации на хромосомах новых генов устойчивости (Lr) к бурой ржавчине у гибридных линий и сортов пшеницы.

Ген LrAi6#2 устойчивости к бурой ржавчине выявлен при молекулярно-генетическом и цитологическом анализе сортов мягкой пшеницы Тулайковская5, Тулайковская10 и Тулайковская100.

Ген LrTt2, интрогрессирован в геном мягкой пшеницы от Triticumtimopheevii, определяет устойчивость к бурой ржавчине, картирован ранее на длинном плече хромосомы 5В.

Ген LrAsp5, интрогрессирован в геном мягкой пшеницы от Aegilopsspeltoides, определяет устойчивость к бурой ржавчине, локализован на длинном плече хромосомы 5В (рис.46, а).

Разработаны ПЦР маркеры Xbarc232 иXcgi15 для генов LrTt2 и LrAsp, соответственно (рис.46, б), которые могут эффективно использоваться для отбора устойчивых линий пшеницы при проведении маркер-ориентированного отбора.

 

Рис.46 а – локализация транслокации от дикорастущего видаAegilopsspeltoides, несущей генLrAsp5на хромосоме 5В методомinsituгибридизация; б – ПЦР-анализ с маркеромXcgi15растений от скрещивания линии 21-4 (донор генаLrAsp1) и сорта мягкой пшеницы Филатовка.

Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН Б.21 «Основы фундаментальных исследований нанотехнологий и наноматериалов» (координатор– акад. Ж.И.Алферов)

Проект 24.56. Эллипсометрическое изучение закономерностей модуляции поверхност­ного плазмонного резонанса различными биологическими субстратами для разработки новых подходов к диагностике заболеваний человека(чл.-корр. РАМН М.И.Воевода)

Методом измерения изменений отражения поляризованного света вблизи поверхностного плазмонного резонанса (ППР) было проведено исследование кинетики взаимодействия образцов сыворотки крови здоровых людей и лиц, страдающих колоректальным раком (КР) смоноклональными антителами СД24 в целях ранней диагностики онкологических заболеваний. Детекцию белка CD24 в сыворотках крови, взятых у здоровых людей и больных КР, проводили при помощи разработанного в рамках проекта особо прецизионного плазмонного эллипсометрического комплекса «Эллипс-СПЭК» и прибора ProteOn XPR36 (BioRad).

Осуществлена оптимизация обработки поверхности пластин в целях увеличения селективности к связыванию антитела с антигеном и повышению адсорбционной способности поверхности. Антитела к белку CD24 человека ковалентно связывали с поверхностью сенсорного чипа GLC. Оптимизация обработки образцов позволила достичь интенсивности сигнала у больных КР~250 RU (1RU = 1 пг белка/ 1 мм2), при этом у здоровых лиц интенсивность связывания была почти в 10 раз ниже (рис. 1).

Исследованы особенности формирования тонких пленок, полученных методом центрифугирования из сывороток крови пациентов с диффузной патологией печени (ДПП), с помощью спектральной и сканирующей эллипсометрии для выявления особенностей, связанных со стадией заболевания, наличием осложнений, динамикой в результате проводимой терапии. Выявлены достоверные различия в значениях показателя преломления пленок больных ДПП и лиц группы сравнения (рис. 48).

Рис.47. Типичные сенсограммы взаимодействия антигенов сыворотки крови и антител СД24 для больных КР (1, 2), прошедших терапию (3) и лиц группы контроля (4) при разбавлении сыворотки 1:50.
Рис.48. Дисперсионные зависимости пленок на основе сыворотки крови больных фиброзами печени разной степени тяжести и лиц группы контроля.
 


Проведен сравнительный анализ оптических характеристик тонких пленок на основе сыворотки крови с биохимическими параметрами сывороток крови. Установленные корреляции могут быть эффективно использованы в ранней диагностике заболеваний внутренних органов человека.

Вверх