2011 год

Важнейшие результаты 2011 год

РЕЗУЛЬТАТЫ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ РАБОТ 
ПО «БАЗОВЫМ» ПРОЕКТАМ

Приоритетное направление VI.45. Общая генетика.
Программа VI.45.1. Генетические основы эволюции и селекции. Реконструкция и модификация геномов методами хромосомной и генной инженерии (координатор акад. РАН В.К. Шумный). 
Программа СО РАН VI.45.1.1. 
Особенности взаимодействия генетических и средовых факторов в формировании фенотипов человека в Северной Азии (координатор чл.-корр. РАМН М.И. Воевода)

Впервые на российской популяции изучена ассоциация артериальной гипертензии с однонуклеотидными полиморфизмами (ОНП), идентифицированными в крупномасштабных полногеномных исследованиях в Западной Европе и США в качестве генетических маркеров этого заболевания. Нами была подтверждена ассоциация артериальной гипертензии с ОНП маркером rs1378942 в гене CSK:для гетерозиготного генотипа АС установлено повышение риска артериальной гипертензии. Установлено, что уровень пульсового давления достоверно отличается  для разных генотипов ОНП-маркера rs2681472 в гене ATP2B1: максимальный уровень достигается для генотипа GG, а минимальный – для АА. Также показано влияние ОНП-маркера rs4343 в гене ACE на величину индекса атерогенности, отражающего соотношение фракций липидов, значимое для развития атеросклероза. Максимальный уровень индекса характерен для генотипа АА, минимальный – для генотипа GG.

а> б в

Рис. Результаты ассоциативного анализа ОНП.

а – частоты генотипов rs1378942 в контрольной группе и у пациентов с артериальной гипертензией (АГ); б – средний уровень пульсового артериального давления у носителей разных генотипов rs2681472; в – средний уровень индекса атерогенности у носителей разных генотипов rs4343.

Приоритетное направление РАН VI.45.; Программа СО РАН VI.45.1.2. Генофонды и генетическое разнообразие природных и экспериментальных популяций (координатор д.б.н. И.К. Захаров)

В природной популяции Drosophila melanogaster впервые были обнаружены два новых инсерционных аллеля одного из генов цитохрома P450 (Cyp6g1), несущие сложную встройку из комбинации двух разных мобильных генетических элементов. Широко распространённый инсерционный аллель Cyp6g1 несет в 5?-регуляторной области вставку мобильного элемента Accord, что приводит к гиперэкспрессии Cyp6g1 и обуславливает устойчивость мух к ксенобиотикам. В 2 изосамочьих линиях, полученных из природной популяцииDrosophila melanogaster Горно-Алтайска, были обнаружены два новых аллеля Cyp6g1, несущие в 5?-регуляторной области большую встройку, при секвенировании которой было выявлено, что ПЦР-продукт фрагмента 5?-регуляторной области гена Cyp6g1, кроме регуляторной последовательности гена, несет встройку мобильного элемента Accord, в который, в свою очередь, встроился делетированный P-элемент (KP-элемент).

Рис. Схема инсерции сложного конструкта из Accord-последовательности и внедренного в нее последовательности KP-элемента в регуляторную область гена Cyp6g1.

Серым цветом обозначены экзоны гена. Синим цветом – фрагмент регуляторной зоны.

Приоритетное направление РАНVI.45.;Программа СО РАН VI.45.1.3.Структурно-функциональная геномика эукариот: описторхиды и их хозяева (координатор д.б.н. В.А. Мордвинов)

Впервые у возбудителя описторхоза Opisthorchis felineus обнаружен ген, кодирующий белок из семейства CYP450, участвующего в биотрансформации ксенобиотиков и лекарственных препаратов. Хотя на уровне аминокислотной последовательности гомология CYP O. felineus с белками CYP450 других эукариот составляет всего 20–24 %, конформационно  белок CYP O. felineus в значительной мере совпадает с белками подсемейства CYP2 млекопитающих, в частности, CYP2E1 человека (рис.). Выявленное конформационное сходство белков биотрансформации ксенобиотиков O. felineus и человека указывает на высокую вероятность совпадения их функций. Полученные данные являются важным вкладом в исследование механизмов отношений паразит-хозяин и формирования лекарственной устойчивости гельминтов.


Рис. Суперпозиция третичных структур белков CYP O. felineus и CYP2E1 человека.

Приоритетное направление РАН VI.45.; Программа СО РАН VI.45.1.4. Генетические и этолого-физиологические механизмы оптимизации воспроизводства и подходы к сохранению генофонда млекопитающих (координатор д.б.н. М.П. Мошкин)

Комбинация методов высокопольной томографии и ЯМР-спектроскопии позволяет получать ценную информацию о прижизненных характеристиках  морфологии и функции мозга лабораторных животных, а также об особенностях распределения  метаболитов по тканям и органам. Совместно с  МТЦ СО РАН проведено прижизненное изучение особенностей мозга у мышей линии ASC селекции ИЦиГ СО РАН с наследственной предрасположенностью к каталепсии и депрессивно-подобному поведению. Установлено, что мыши линии ASC характеризуются существенно менее развитым мозолистым телом, нервные волокна которого в нормальной ситуации  обеспечивают межполушарные связи мозга (рис.), а также различаются  по соотношению метаболитов в мозге, влияющих на баланс процессов торможения и возбуждения.

Рис. Согласно результатам томографического анализа, мыши линии ASC характеризуются существенно менее развитым мозолистым телом по сравнению с контрольными животными (линия AKR) (p < 0,01).

Красным цветом отмечена область мозолистого тела. Цифрами обозначены относительные размеры мозолистого тела (в % от общей площади мозга).

Приоритетное направление РАН VI.45.; Программа СО РАН VI.45.1.5. Изучение механизмов интрогрессивной гибридизации и генетического контроля стрессоустойчивости растений с помощью методов хромосомной и генной инженерии (координатор д.б.н. Л.А. Першина)

Созданы новые генетические модели – изогенные линии озимого сорта мягкой пшеницы Безостая 1, несущие гены Vrn, определяющие  яровой тип развития и время колошения мягкой пшеницы. Изучение этих линий позволило доказать наличие множественного аллелизма гена Vrn-B1 ивыявить критический период в развитии растений мягкой пшеницы, определяющий продолжительность всего вегетационного развития от всходов до колошения и созревания. Такой период – продолжительность времени от появления первого узла до формирования стебля (рис.) находится под контролем гена Vrn-A1 и каждого из изученных аллелей гена Vrn-B1. Созданные линии включены в исследования молекулярно-генетических механизмов регуляции продолжительности вегетационного периода мягкой пшеницы. 

Рис. Периоды развития изогенных линий и озимого сорта пшеницы Безостая 1.

Растения выращены в гидропонной теплице без яровизации. Обозначение: i:Vrn-A1,  i:Vrn-B1a,i:Vrn-B1c  – изогенные линии сорта пшеницы  Безостая 1.

Приоритетное направление РАН VI.45.; Программа СО РАН VI.45.1.6. Преобразования структуры и функции хромосом в эволюции, онтогенезе и клеточном цикле (координатор д.б.н. Н.Б. Рубцов)

Показано, что в отличие от изученных ранее близкородственных видов у генетически более удаленных видов (виды лесных мышей рода Apodemusпо отношению друг к другу, а также к видам лесных мышей рода Sylvaemus) сохраняются только небольшие кластеры гомологичных повторов на отдельных хромосомах. Такие кластеры локализованы, в основном, не в прицентромерных С-позитивных районах, а на их границе с эухроматиновыми районами аутосом или в С-позитивных районах половых хромосом (рис.). Данные результаты свидетельствуют о снижении гомологии повторенных последовательностей ДНК, составляющих прицентромерные районы хромосом, при увеличении степени дифференциации и уменьшении родства сравниваемых форм и видов лесных мышей (т. е. при переходе от конспецифичных популяций и внутривидовых форм к аллопатричным и «хорошим» видамSylvaemus, а затем – к далеким видам). Наряду с вырождением ДНК-повторов, по-видимому, происходит постепенное разрушение их кластеров и замена новыми, негомологичными последовательностями во всех или почти всех прицентромерных районах хромосом.

Рис. Многоцветная FISH трех микродиссекционных ДНК-проб, полученных из прицентромерных районов хромосом S. sylvaticus (зеленый сигнал), S. flavicollis (желтый сигнал) и S. ponticus(красный сигнал) с метафазными хромосомами A. agrarius. Окраска хромосом DAPI (синий сигнал).  

 

Приоритетное направление РАН VI.45.; Программа СО РАН VI.45.1.7. Физическое картирование и секвенирование генома мягкой пшеницы. Cтруктурная организация и эволюция индивидуальных хромосом и генов (координатор д.б.н. Е.А. Салина)

Нами впервые показано, что в дифференциации В- и D-геномов мягкой пшеницы существенную роль играли процессы амплификации LTR-ретротранспозонов, относящихся к двум семействам: Fatima и Lila. При анализе первичной структуры протяженных участков ДНК (80–120 тыс. п.н.) и методом in situ гибридизации были выявлены LTR-ретротранспозоныFatima и Lila, имеющие преимущественную локализацию на хромосомах В- и D-геномов, соответственно (рис.). Филогенетический анализ последовательностей ДНК LTR-ретротранспозонов, представленных в базах данных, с одновременной оценкой времени их инсерции, показал, что распространение ретроэлементов Fatima и Lila происходило 0,5–2,5 млн лет назад, что соответствует времени формирования диплоидных предшественников мягкой пшеницы. Полученные нами данные подтверждают единый для каждого из трех геномов гексаплоидной пшеницы сценарий формирования геном-специфичных мобильных элементов в составе диплоидных видов-предшественников.

Рис. Локализация LTR-ретротранспозонов Fatima и Lila на хромосомах B- и D-геномов мягкой пшеницы, соответственно.

Идентификация хромосом В-генома проводилась согласно расположению маркера pSc119.2 (красный цвет); хромосомы D-генома были идентифицированы по расположению маркера pAs1 (зеленый цвет). Внизу представлены схемы ретротранспозонов с указанием длинного терминального повтора – LTR (cтрелки), а также основных кодирующих доменов (gag – cтруктурный белок вириона; AP – аспартатная протеиназа; RT – обратная транскриптаза; RH – РНКаза H; INT – интеграза; ORF2 – дополнительная открытая рамка считывания с неизвестной функцией). Над схемами красными линиями обозначена локализация клонированных фрагментов ретротранспозонов, использованных в качестве зондов для in situгибридизации.

 

Приоритетное направление РАН VI.45.; Программа СО РАН VI.45.1.8. Механизмы формирования генетического разнообразия растений, создание коллекций уникальных генофондов, доместикация, эволюция растений (координатор акад. В.К. Шумный, исп. д.б.н. К.К. Сидорова)

Разработана новая генетико-селекционная стратегия селекции бобовых растений на высокие показатели симбиотической азотфиксации (на примере созданной в ИЦиГ СО РАН коллекции мутантов гороха). Селекция велась по параметрам, позволяющим через макросимбионт (растение) вести отбор новых форм бобовых, сочетающих достаточную продуктивность и высокий показатель азотфиксации. Это достигается в процессе комбинирования рецессивных и доминантных аллелей разных симбиотических генов; с последующим отбором лучших рекуррентных линий (рис.). Для расширения биоразнообразия в исследованиях по симбиогенетике включен новый вид бобовых растений – чина, а также дикие виды гороха. Показано, что все дикие формы гороха способны к симбиозу с культурным штаммом ризобий.

Рис. Корни гороха. 1 – сорт Дружная (Nod5); 2 – суперклубеньковый мутант К301, (nod4); 3 – рекуррентная линия К720 ультрасупер (nod4 Nod5).

 

Приоритетное направление РАН. 6.47.; Программа СО РАН VI.47.1. Молекулярная генетика. Механизмы реализации генетической информации. Биоинженерия. Программа VI.47.1. Механизмы контроля молекулярно-генетических систем и процессов. Нанобиоинженерия. 1. Механизмы транскрипционной регуляции экспрессии генов и соматического мутагенеза (координатор д.б.н. Т.И. Меркулова)

С использованием мышей, нокаутных по рецептору ксенобиотиков – транскрипционному фактору CAR, мы показали, что этот регуляторный белок играет ключевую роль в химически индуцированном гепатоканцерогенезе. Установлено, что гепатоканцерогенные аминоазокрасители ОАТ и 3?-МеДАБ является лигандами CAR, повышающими его активность, что приводит к усилению экспрессии генов-мишеней этого белка. Среди генов-мишеней CAR был выявлен известный протоонкоген c-Myc, активация которого усиливает пролиферацию и приводит к злокачественному перерождению клеток. Показано, что пролиферация клеток печени под действием гепатоканцерогена ОАТ хронически повышена у контрольных животных (рис., а) и не изменена у нокаутных мышей, у которых отсутствует ген  CAR (рис., б). Полученные результаты важны для понимания механизмов химического канцерогенеза.

Рис. Срезы печени мышей дикого типа (а) и CAR-нокаутных мышей (б). Темные гранулы – включение бромодезоксиуридина (BrdU) в клетки печени. (в) – результаты количественной обработки данных по 9 животным в каждой группе. Увеличение включения BrdU при введении гепатоканцерогена ОАТ мышам дикого типа свидетельствует о стимуляции пролиферации под действием ОАТ, а отсутствие изменений у CAR-нокаутных мышей о ключевой роли CAR в механизме  стимулирующего эффекта гепатоканцерогена на пролиферативные процессы.

Приоритетное направление РАН. 6.47.; Программа СО РАН VI.47.1. Молекулярная генетика. Механизмы реализации генетической информации. Биоинженерия. Программа VI.47.1. Механизмы контроля молекулярно-генетических систем и процессов. Нанобиоинженерия. 2. Нанобиоинженерия, протеомика: новые методы исследования биообъектов (координатор к.б.н. С.Е. Пельтек)

Разработан (совместно с Институтом физико-химической биологии ФМБА) новый подход к поиску белков, перспективных для биотехнологии. Подход основан на параллельном высокопроизводительном секвенировании метагеномов и компьютерном анализе: сборке коротких секвенированных фрагментов в протяженные геномные последовательности (контиги); поиске в них открытых рамок считывания; функциональной классификации кодируемых ими ферментов и предсказании количественных величин их функциональной активности. На основе анализа результатов секвенирования метагенома микробных сообществ озера «Кротовья ляга», выполненного на платформе SOLiD, идентифицирован белок гликозидаза (фермент деградации целлюлозы) с высокой функциональной активностью (рис.).

Рис. Новый подход к поиску белков, перспективных для биотехнологии, основанный на параллельном высокопроизводительном секвенировании метагеномов и компьютерном анализе.

а – предсказание значения количественной величины константы Михаэлиса для потенциальной гликозидазы в реакции расщепления целлобиозы; б– реконструированная модель пространственной структуры гликозидазы, обладающей повышенной активностью расщепления целлобиозы.

Приоритетное направление VI.49. Клеточная биология. Теоретические основы клеточных технологий
Программа VI.49.1. Клеточные и молекулярные механизмы, регулирующие онтогенез и морфогенез. Технологии управления дифференцировкой и пролиферацией клеток 
Программа СО РАН VI.49.1.1. Транскрипционные факторы, организация хромосом и интерфазного ядра и цитоплазмы при дифференцировке и перепрограммировании геномов дифференцированных клеток (координатор д.б.н. О.Л. Серов)

Импринтированый локус Dlk1-Dio3 – важный регулятор индивидуального развития, нарушения метилирования которого приводят к остановке развития. В 95 % линий индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПС) клеток обнаружены нарушения метилирования локуса Dlk1-Dio3 (рис., б). Считается, что это результат  форсированной экспрессии транскрипционных факторов, «запускающих»  репрограммирование. Нами впервые показано, что такие нарушения вметилировании Dlk1-Dio3 свойственны также и эмбриональным стволовым клеткам (ЭСК) (рис., а). Полученные данные  свидетельствуют о том, что механизмы нарушения метилирования в Dlk1-Dio3 локусе не связаны с самой технологией получения иПС клеток и репрограммированием, а являются результатом клеточной селекции in vitro.

Рис. Анализ метилирования ДНК локуса Dlk1-Dio3 мыши методом COBRA.

Справа отмечены фрагменты ДНК метилированых и неметилированых аллелей Dlk1-Dio3. Отсутствие фрагментов – свидетельство нарушения баланса метилированных и неметилированных аллелей. а – метилирование локуса Dlk1-Dio3 в 5 линиях ЭС клеток, в линии 4-1D-14 локус гипометилирован; б – паттернметилирования локуса Dlk1-Dio3 в 6 линиях ИПС клеток, в линии iBl2 локус гипометилирован, в линиях iBl1 и iBl5 – гиперметилирован.

Приоритетное направление VI.50. Биофизика. Радиобиология. Математические модели в биологии. Биоинформатика Программа СО РАН VI.50.1. Компьютерно-экспериментальный анализ и моделирование молекулярно-генетических, биофизических, экосистемных и биосферных процессов Программа СО РАН VI.50.1. 2. Биоинформатика и системная биология молекулярно-генетических систем и процессов (координатор акад. Н.А. Колчанов)

Разработана математическая модель жизненного цикла репликона вируса гепатита С в  гепатоцитах человека (рис.). Модель предназначена для поиска оптимальных стратегий фармакологического подавления репликации вирусной РНК. Показано, что совместное применение ингибиторов, блокирующих трансляцию вирусного генома и процессинг вирусного полипротеина, обеспечивает синергичный эффект подавления репликации вирусной РНК в клетке. Одновременное применение ингибиторов приводит к значительному подавлению вирусного репликона даже при их малых концентрациях, которые при индивидуальном воздействии недостаточны для подавления репликации. Таким образом, разработанная модель позволяет осуществлять поиск комбинаций лекарств с целью достижения наибольшего противовирусного эффекта и наименьшей токсичности ингибиторов.

Рис. Математическое моделирование влияния ингибиторов вируса гепатита С на репликацию вирусной РНК.

а – рассматриваемые процессы жизненного цикла репликона вируса гепатита С; б – первые шесть дифференциальных уравнений математической модели; в – динамика подавления репликации вирусной РНК в результате раздельного и совместного действия ингибиторов: зеленая линия – ингибитора трансляции (400 нМ), черная линия – ингибитора NS3 протеазы (1000 мкМ), синия линия – совместное действие двух ингибиторов при тех же концентрациях.

Приоритетное направление VI.51. Биотехнология Программа VI.51.1. Микробиология и вирусология, искусственные генетические системы, биотехнологии создания терапевтических препаратов и новых материалов (координатор акад. В.В. Власов) Программа СО РАН VI.50.1.5. Генетически модифицированные растения и животные как продуценты фармакологически ценных белков (координатор д.б.н. Е.В. Дейнеко)

При создании трансгенных растений табака выделены уникальные линии с высоким уровнем (более 40 %) цитомиксиса, используемые в качестве моделей для изучения фундаментальной проблемы межклеточных взаимодействий. Цитомиксис, или межклеточное перемещение ядер по цитомиктическим каналам (рис., а), исследован на клеточном и ультраструктурном уровнях. Результатом цитомиксиса может быть слияние оболочки перемещающегося ядра с оболочкой ядра клетки-реципиента и образование межъядерного мостика (рис., б). Показано, что перемещение ядер не связано с нарушениями функций тубулинового цитоскелета (рис., в). Впервые установлено, что формирование цитомиктических каналов происходит с участием сферосомоподобных везикул (рис., г), содержимое которых обладает ферментативной активностью (рис., д).

Рис. Цитомиксис в материнских клетках пыльцы трансгенных растений табака.

а – цитомиксис (указано стрелками) в профазе 1 мейоза; б – стрелкой указан сформированный межъядерный мостик, на врезке представлен его увеличенный фрагмент; в – нормальный тубулиновый цитоскелет в цитомиктичных клетках в профазе 1 мейоза (зеленый цвет – цитоскелет; синий цвет – перемещающееся ядро); г – сферосомоподобная везикула; д – распад везикулы и выделение фермента каллазы при формировании межклеточного цитомиктического канала (указано стрелкой).

Обозначения: я – ядро; кс – клеточная стенка; хр – хроматин; сф – сферосомоподобная везикула.
Приоритетное направление VI.52. Физиология нервной и висцеральных систем. Клиническая физиология
Программа VI.52.1. Генетико-физиологические механизмы гормональной регуляции висцеральных функций и поведения. Доместикация как модель эволюции
Координатор – акад. Л.Н. Иванова
Программа VI.52.1.1. Функциональная нейрогеномика: анализ полиморфизма и экспрессии генов, обеспечивающих функции мозга и поведение  (координатор д.б.н. 
Н.Н. Дыгало
)

Выявлена ассоциация экспрессии антиапоптозного белка Bcl-xL в стволовой части головного мозга, где расположены основные группы серотонинергических нейронов, которые являются мишенью для наиболее распространенных в настоящее время антидепрессантов, с формированием психоэмоциональной устойчивости к действию стресса в ходе курса антидепрессантной терапии. Потребление в течение 2 недель флюоксетина, одного из таких антидепрессантов, не влияло на уровень мРНК Bcl-xL в стволе мозга после стресса, вызванного принудительным плаванием. Уровень этого транскрипта повышался после стресса у животных, получавших флюоксетин в течение 4 или 8 недель. Поведенческий антидепрессантный эффект флюоксетина также проявлялся лишь при его применении более 2 недель. Эти результаты совместно с достоверной отрицательной корреляцией уровня мРНК Bcl-xL с поведенческим проявлением депрессивноподобного состояния свидетельствуют о том, что экспрессия этого антиапоптозного белка в стволовой части головного мозга вовлечена в механизм действия антидепрессанта, обеспечивающего формирование устойчивости к проявлению психопатологии в условиях стресса.

Рис. Индукция стрессом повышения уровня мРНК Bcl-xL в стволовой части головного мозга (а) и изменение индекса депрессивноподобного состояния (продолжительность неподвижности животных в тесте вынужденного плавания) (б) в течение 8-недельного курса применения антидепрессанта флюоксетина. 

Приоритетное направление VI.52.  Физиология нервной и висцеральных систем. Клиническая физиология
Программа VI.52.1. Генетико-физиологические механизмы гормональной регуляции висцеральных функций и поведения. Доместикация как модель эволюции
Программа VI.52.1.2. Физиологическая генетика эндокринной регуляции функций, поведения и доместикации (координатор акад. Л.Н. Иванова)

Эпителиальные клетки почечных канальцев, кишечника, слюнных желез и др. органов, подвергающихся действию внеклеточной среды с меняющейся осмолярностью, способны противостоять разбуханию или сморщиванию, восстанавливая свой объем и сохраняя жизнеспособность в условиях гипо- или гипертонической среды. С использованием разработанного метода компьютерной морфометрии на изолированных фрагментах собирательных трубок почки крысы впервые проведено экспериментальное исследование процесса регуляторного снижения объема клеток в ответ на осмотический шок (снижение осмолярности внеклеточной среды с 280 до 140 мОcмоль/л) и создана математическая модель поведения клетки с высокой степенью соответствия экспериментальным данным. Получен профиль интенсивности трансмембранных потоков осмолитов, определяющих снижение клеточного объема, согласно которому наиболее существенный вклад в регуляторное снижение объема вносят KСl-котранспортер (JKCC),  диффузионный поток К+ и органических ионов Х (JK и JX).

Рис. а – изменение отноcительного объема V/V0 главныx клеток cобиpательныx тpубок почки пpи воздейcтвии гипотоничеcкой cpеды в экcпеpименте и в модели в завиcимоcти от вpемени: (уcpедненная экcпеpиментальная запиcь флюоpеcценции кальцеина, n = 6, c указанием cтандаpтной ошибки) и модель пpоцеccа восстановления объема при гипоосмотическом шоке). Веpxняя шкала отpажает изменение оcмоляpноcти омывающего pаcтвоpа (мОcмоль/л); б – схематическое изображение моделируемой клетки; в – моделирование потоков осмолитов в клетках эпителия почки при гипоосмотическом шоке. Jn – потоки ионов.
Приоритетное направление VI.53.  Эволюционная, экологическая физиология, системы жизнеобеспечения и защиты человека 
Программа VI.53.1. Создание моделей патологических состояний человека: исследование генетико-физиологических, молекулярно-генетических и биофизических механизмов
Программа VI.53.1. 1. Исследование и экспериментальное моделирование болезней человека: молекулярно-генетические, морфофизиологические и биофизические механизмы (координатор д.б.н. А.Л. Маркель)

Изучение генетико-физиологических механизмов развития катаракты в раннем возрасте имеет существенное значение для выявления причин возникновения данной патологии. При исследовании крыс линии OXYS, для которых характерно раннее развитие процессов общего старения организма с сопутствующим возникновением типичной катаракты, было показано наличие существенных изменений экспрессии генов, кодирующих основные белки хрусталика – кристаллины. В раннем препубертатном возрасте экспрессия генов кристаллинов в хрусталиках глаз крыс OXYS значительно повышена, затем она начинает быстро снижаться, и у взрослых крыс экспрессия гена ?В-кристаллина во много раз меньше, чем у контрольных крыс того же возраста (рис.). Обнаруженная возрастная динамика изменения экспрессии кристаллинов при раннем развитии катаракты свидетельствует о том, что имеются генетические предпосылки возникновения патологии, проявляющиеся задолго до начала заболевания. Учет изменения экспрессии кристаллинов может иметь важное значение для ранней профилактики катаракты.

Рис. Возрастные изменения мРНК генов кристаллинов в хрусталиках глаз крыс OXYS (желтые столбцы) и Wistar (синие столбцы).

РЕЗУЛЬТАТЫ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ РАБОТ ПО ПРОГРАММАМ ПРЕЗИДИУМА РАН

Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН А.II.3 
Химические аспекты энергетики  (координатор акад. И.И. Моисеев)

Проект 13. Поиск, селекция и изучение перспективных бактериальных штаммов-продуцентов для переработки глицерина (акад. Н.А. Колчанов)

Создана генетическая конструкция и оптимизирована методика трансформации K. pneumoniae, позволяющая модифицировать отдельные последовательности в составе ее генома. Секвенирована и изучена структура отдельных участков генома штамма бактерии Klebsiella pneumoniаe W18, осуществляющего биоконверсию глицерина в 1,3-пропандиол с высоким выходом. Проведена генетическая модификация ранее изолированного штамма бактерии  Klebsiella pneumoniae W18 с целью улучшения биосинтеза 1,3-пропандиола при культивировании на средах, содержащих глицерин. Показано, что при инактивации гена пируват декарбоксилаза наблюдается увеличение продукции 1,3-пропандиола. 
В ходе проведенных работ  были исследованы участки генома Klebsiella pneumoniae W18, включающие оперон синтеза 1,3-пропандиола (3843263–3860371 п.н.о.) и 2,3-бутандиола (2337407–2338177) (рис.).

Рис. Анализ фрагмента структуры района dha регулона ДНК генома Klebsiella pneumoniae. ORF-1:ORF-4 – открытые рамки считывания; РО-1:РО-4 – регуляторные районы; orfY, orfW – неидентифицированные участки ДНК.

Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН А.II.5 Фундаментальные науки – медицине (координатор акад. А.И. Григорьев)

Проект ФНМ-11. Молекулярные механизмы развития хориоретинальной дегенерации у крыс OXYS – первой отечественной модели возрастной макулодистрофии для исследования патогенеза, разработки способов лечения и профилактики (д.б.н. 
Н.Г. Колосова)

Способность растений, обладающих антиоксидантыми свойствами, замедлять возрастные изменения известна. В последние годы доказано, что антиоксидантной, противовоспалительной и/или иммуномодулирующей активностью обладают фенилэтаноиды и полисахариды Cistanche deserticola – «Женьшеня пустыни», используемого в традиционной китайской медицине более 2000 лет. Сведений о влиянии CD на возрастные изменения организма  в научной литературе практически нет. Нами исследовано влияние CD  на развитие ретинопатии у крыс OXYS. Животные с возраста 12 до 14 мес. получали по 15 мг/кг в день измельченных до диаметра 10–70 мкм частиц высушенного растения. Осмотры, выполненные помощью прямого офтальмоскопа до и после лечения, показали (рис.), что у контрольных крыс OXYS ретинопатия прогрессировала, а CD не только предупредил дальнейшее развитие заболевания, но и достоверно снизил выраженность патологических проявлений ретинопатии.

Рис. Влияние Cistanche deserticola на развитие ретинопатии у крыс OXYS.

Результаты представлены в процентах глаз, соответствующих стадии заболевания (0 – 3). а и б – опытные животные до и после лечения; в и г – контрольные крысы OXYS  в начале и в конце периода наблюдений. Количество животных в группе – 15 (30 глаз). Справа – примеры картины глазного дна крыс OXYS с разными стадиями заболевания, изображения получены с помощью ручной цифровой фундус-камеры Kowa Genesis-D.

Проект ФНМ-14. Хроническая тревога и иммунодефицит: поиски рациональной фармакотерапии. Инновационное исследование. ФНМ-14. Хроническая тревога и иммунодефицит: поиски рациональной фармакотерапии. Инновационное исследование (д.б.н. Н.Н. Кудрявцева)

Ранее было показано, что хронический социальный стресс, приводящий к развитию тревожно-депрессивного состояния у самцов мышей, изменяет процентное соотношение клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла в тимусе и селезенке. Изменения в тимусе полностью восстанавливались после двухнедельного периода отдыха (без стрессирующего воздействия), однако хроническое введение кломипрамина (40 мг/кг) в течение двух недель привело к формированию некоторого дисбаланса в соотношения клеток, находящих в фазах пролиферации и покоя по сравнению с контрольным состоянием. В селезенке процентное соотношение клеток, находящихся в фазе пролиферации, оставалось все еще измененным после двухнедельного периода относительного отдыха. Под влиянием хронического введения антидепрессанта кломипрамина (40 мг/кг) процентное соотношение клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла, уже не отличалось от контроля.

 

Рис. Влияние кломипрамина на процентное соотношение клеток в разных фазах клеточного цикла у тревожно-депрессивных животных в тимусе и селезенке.

Белые столбы – контроль; серые столбы – тревожно-депрессивные самцы после введения физиологического раствора, черные столбы – самцы после хронического введения кломипрамина. p < 0,05; по сравнению с контролем (интактные), + p < 0,05, по сравнению с тревожно-депрессивными самцами после введения физиологического раствора, t-критерий. Данные получены при участии сотрудников НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН.

 

Проект ФНМ-23. Раннее выявление мутаций в генах EGFR и K-Ras для диагностики и развития персонализированных методов лечения немелкоклеточного рака легких (д.б.н. Т.И. Меркулова)

На основе данных проекта ENCODE о местах связывания факторов транскрипции (ChIP-seq), базы данных dbSNP NCBI и матриц Jaspar для функциональной интерпретации SNP разработан новый подход к поиску потенциально регуляторных SNP (rSNPs) в геноме человека. Экспериментальная проверка показала высокую эффективность данного подхода: 22 и 45 отобранных SNPs  резко меняли картину связывания белков экстракта ядер хотя бы одной из 4 линий клеток человека (примеры на рис.), т. е. действительно оказались потенциальными rSNPs. На основе анализа SNP с помощью разработанного программного продукта и экспериментальной проверки создана база данных регуляторных SNP (http://www.lungry.bionet.nsc.ru/cgi-bin/SNPProject/SNPChIPTools.cgi).

Рис. Содержание базы данных регуляторных SNPs человека.
Примеры экспериментального исследования SNPs. Стрелками показаны изменения в связывании транскрипционных факторов.

Проект ФНМ-39. Физиологические и молекулярно-генетические исследования почечных функций в процессе формирования стресс-зависимой артериальной гипертонии. Экспрессия генов эпителиального натриевого канала (ENaC) при стресс-зависимой артериальной гипертонии (крысы линии НИСАГ) (акад. Л.Н. Иванова)

Стресс у гипертензивных крыс сопровождается усилением натрийзадерживающего механизма почки. Несмотря на то, что почка у крыс НИСАГ на фоне развитой артериальной гипертензии сохраняет свои функциональные возможности, повышенная стресс-реактивность этих крыс является причиной смещения водного и электролитного баланса в сторону накопления натрия и воды, что способствует поддержанию гипертензивного статуса.

Рис. Относительный уровень экспрессии мРНК гена ENaC-? в корковом (а) и мозговом (б) веществе почки крыс НИСАГ и WAG в покое и в условиях эмоционального стресса (среднее значение ± доверительный интервал, p < 0,05). 
1 – НИСАГ в покое; 2 – НИСАГ в условиях эмоционального стресса; 3 – WAG в покое; 4 – WAG в условиях эмоционального стресса. 
*** p < 0,001 – реакция на стресс; # p < 0,05 – межлинейные отличия.

 

Проект ФНМ-43. Применение нейротрофического фактора мозга (BDNF) для коррекции наследственных нарушений функции мозга и поведения (д.м.н. Н.К. Попова)

Впервые обнаружено, что однократное центральное введение нейротрофического фактора мозга (Brain-Derived Neurotrophic Factor; BDNF) вызывает существенное подавление выраженности реакции замирания у мышей линии ASC (Antidepressant Sensitive Catalepsy), полученных в лаборатории нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН в результате длительной селекции на предрасположенность к наследственной каталепсии и характеризующихся депрессивноподобными чертами поведения. Данные исследования свидетельствуют о том, что BDNF проявляет свойства перспективного антидепрессанта, а линия ASC может быть использована как удобная модель для изучения механизмов действия BDNF.

Рис. Влияние центрального введения нейротрофического фактора мозга BDNF (0,3 мкг) на проявление каталепсии у мышей линии ASC. * p < 0,05 по сравнению с контролем.

Проекты программы фундаментальных исследований Президиума РАН А.II.6 Молекулярная и клеточная биология (координатор акад. Г.П. Георгиев)

Проект 6.8. Системная биология: компьютерно-экспериментальные подходы 
(акад. Н.А. Колчанов)

Проведена экспериментальная проверка разработанной нами компьютерной модели, описывающей трехэтапный процесс формирования комплекса ТВР-ТАТА, включающий: 1) неспецифическую  посадку ТВР-белка и его одномерную диффузию вдоль ДНК; 2) первичное распознавание ТАТА-бокса; 3) формирование  равновесного комплекса ТВР/ТАТА. В стандартизированной тест-системе in vitro были измерены величины равновесной константы диссоциации (KD) комплекса ТВР/ТАТА для пяти нормальных ТАТА-боксов человека  и их мутационных вариантов, ассоциированных с патологиями. Проверка показала соответствие прогнозов in silico  экспериментым данным (p < 0,05).

Рис. Экспериментальная проверка компьютерной модели, описывающей трехэтапный процесс формирования комплекса «ТАТА-бокс/белок ТВР человека».

а – трехэтапная схема процесса формирования равновесного комплекса «ТАТА/ТВР»; б – уравнение для расчета равновесной константы диссоциации (KD) комплекса ТАТА/ ТВР; в – нуклеотидные последовательности ТАТА-боксов человека (болезнь и норма); в изменения аффинности ТВР/ТАТА при нуклеотидных заменах в ТАТА-боксах различных генов, ассоциированных с болезнями.

Проект 6.9. Молекулярная биология серотониновой системы мозга в экспериментальных моделях генетической предрасположенности к агрессии и депрессии (д.м.н. Н.К. Попова)

Впервые обнаружено, что центральное введение селективного агониста 5-НТ7 рецепторов LP44 приводит к развитию выраженной и дозозависимой гипотермической реакции. В то же время периферическое введение LP44 в широком диапазоне доз не оказывает влияния на температуру тела. Полученные результаты указывают на вовлечение центральных, но не периферических 5-НТ7 рецепторов в механизмы терморегуляции. Кроме того, эти данные говорят о том, что LP44, используемый для изучения активации 5-НТ7 рецепторов, не проникает через гематоэнцефалический барьер.

Описание: Рис 1 (LP дозы icv и ip)_col

Рис. Эффект центрального (а) и периферического (б) введения селективного агониста 
5-НТ7 рецепторов LP44 в различных дозах на температуру тела мышей линии СВА/Lac.

а – по оси Х указано время после введения препарата; б – температура тела была измерена через 30 мин после периферического введения LP44.

Проект 6.11. Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов эукариот в ходе онтогенеза (д.б.н. С.М. Закиян)

У полевок и крысы значительно изменены экзон-интронная структура, промоторные районы, точки старта и терминации транскрипции ядерной РНК Enox, а также отсутствует транскрипция, соответствующая регуляторному элементу Xite, которые у мыши играют важную роль в регуляции гена Xist, ответственного за инициацию инактивации Х-хромосомы. Показано, что основной промотор, структура и паттерн экспрессии гена Tsix консервативны у полевки, крысы и мыши, что позволяет предполагать его основную роль в регуляции гена Xist у грызунов. Показано, что большая часть РНК гена Tsix полевки и крысы, также как и у мыши, не подвергается сплайсингу и, вероятно, осуществляет репрессию гена Xist за счет транскрипции в районе его промотора.

Рис. а –экзон-интронная структура и границы некодирующих ядерных РНК (EnoxXistTsixXite) и белок-кодирующих генов (LrrrnSlc7a3) в центре инактивации Х-хромосомы у грызунов: мыши, крысы и полеки; б – нозерн-блот анализ паттерна экспрессии гена Tsix у тринадцатидневных эмбрионов полевки и крысы.

Проект 6.12. Изучение структурно-функциональной организации и механизмов сборки ядерной оболочки (к.б.н. Е.В. Киселева)

Впервые продемонстрирована несвойственная для интерфазных ядер  организация ядерной оболочки и центральное расположение компактного хроматина в фоторецепторных клетках сетчатки глаза животных с ночным видением, обеспечивающие прохождение светового сигнала  с минимальными потерями (рис.). 
Характерным свойством интерфазных ядер эукариотических клеток является периферическое расположение гетерохроматина, представляющего функционально неактивные участки хромосом. Недавно показано, что фоторецепторные клетки сетчатки глаза животных с ночным видением имеют центрально расположенный гетерохроматин. Нами впервые проведен детальный анализ структурной организации фоторецепторных клеток мыши и установлено, что они формируют плотные ряды, располагающиеся вдоль линии прохождения света, а также характеризуются необычными межклеточными контактами. Ядерные оболочки и плазматические мембраны соседних фоторецепторных клеток образуют многослойные участки, состоящие из 6 параллельных мембран. Обнаружено, что ядерные оболочки клеток в этих участках не содержат пор. Предполагается, что выявленная необычная организация фоторецепторных клеток сетчатки глаза мыши обеспечивает им функцию мини-линз, увеличивающих интенсивность светового потока при минимальном освещении.

Рис. Специфическая организация ядра фоторецепторных клеток сетчатки глаза мыши, обеспечивающая прохождение светового сигнала с минимальными потерями. а – схема строения глаза и морфология ганглиозной клетки с типичной организацией ядра; б – центральное расположение компактного хроматина, отсутствие цитоплазмы и ядерных пор в участках контакта фоторецепторных клеток сетчатки глаза мышей, относящихся к животным с ночным видением.

Проект 6.15. Молекулярно-генетические механизмы комплексных поведенческих, морфологических и физиологических признаков: экспериментальное исследование на селекционных моделях животных (д.б.н. А.Л. Маркель)

У крыс линии НИСАГ на первой хромосоме идентифицирован локус, ассоциированный с повышением артериального давления при стрессе. В этом локусе расположен ген, ответственный за синтез ключевого фермента биосинтеза катехоламинов (норадреналина и адреналина) – тирозингидроксилазы. Экспрессия этого гена в некоторых отделах мозга, участвующих в регуляции артериального давления, у крыс линии НИСАГ достоверно повышена относительно контрольных нормотензивных крыс линии WAG. Это сочетается с повышением реакции симпатоадреналовой и гипофизарно-надпочечниковой систем на различные виды стресса.

Рис. Экспрессия гена тирозингидроксилазы – ключевого фермента биосинтеза катехоламинов – повышена в отделах мозга гипертензивных крыс линии НИСАГ.

 

Проект 6.16. От поведения к гену: молекулярные механизмы агонистического поведения (д.б.н. Н.Н. Кудрявцева)
Ранее было показано, что развитие тревожно-депрессивного расстройства у самцов мышей под влиянием хронического социального стресса, вызванного повторным опытом социальных поражений в ежедневных межсамцовых конфронтациях, приводит к снижению функциональной активности серотонергической системы мозга на уровне метаболизма и рецепции серотонина. Исследования этого года продемонстрировали вовлечение серотонергических генов в этот процесс: мРНК генов Tph2, Sert, MaoA и 5-ht1A в ядрах шва среднего мозга была существенно ниже, чем у контрольных животных, причем сниженная экспрессия длительно сохранялась после двух недель относительного покоя без каких-либо стрессирующих воздействий.

Рис. УровеньмРНК генов Tph2, Sert, Maoa и Htrt1a в ядрах шва среднего мозга у контрольных животных (светло-голубые столбы), у тревожно-депрессивных самцов (голубые столбы, Losers) и у тревожно-депрессивных самцов после относительного покоя – периода прекращения конфронтационных взаимодействий (тeмно-голубые столбы, Rested losers).

Данные представлены в процентах изменений показателей от среднего уровня у контрольных животных.  * P < 0,05; *** P < 0,001по сравнению с контролем. 
Данные получены при участии сотрудников Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

Проект 6.17. Скрытый кодирующий потенциал эукариотических мРНК: выявление альтернативных сигналов инициации трансляции и новых форм эукариотических белков и биологически активных пептидов (к.б.н. А.В. Кочетов)

Считается, что эффективность терминации трансляции зависит от типа стоп-кодона (UAA, UGA, UAG), нуклеотидного контекста, а также от типа аминокислотных остатков в С-концевых позициях белка. Однако роль этих факторов малоизучена и возможности предсказания эффективности сигнала терминации трансляции и возможности readthrough (считывания стоп-кодона как кодирующего с помощью супрессорных тРНК или тРНК с близким по структуре антикодоном) в настоящее время нет. С помощью компьютерного анализа нами было обнаружено, что в мРНК генов растений комбинация стоп-кодона UGA и аминокислотного остатка глицина в С-концевой позиции коррелировала с высокой частотой тандемного сигнала терминации трансляции (двух стоп-кодонов подряд, например UGAUAA) (рис., а). По-видимому, в мРНК некоторых генов растений используются «запасные» стоп-кодоны, работающие в тех случаях, когда структура С-концевой части белка плохо совместима с эффективной терминацией трансляции. Анализ структуры сигнала терминации трансляции генов Arabidopsis thaliana показал, что мРНК 100–150 генов характеризуются малоэффективным сигналом терминации трансляции и могут дополнительно кодировать удлиненные с С-конца изоформы белков, в настоящее время неизвестные (рис., б).


Рис. а – разность средних частот встречаемости нонсенс-кодонов в проксимальных позициях 3’-НТП мРНК генов Arabidopsis thaliana с различными стоп-кодонами, кодирующих белки с глицином или другой аминокислотой на С-конце (Gly – nonGly); б – структура мРНК с альтернативными сайтами терминации трансляции (UGA, UAA), с которой могут считываться две изоформы белка с разными С-концевыми доменами (показаны стрелками). AUG – старт трансляции, 60S, 40S – субъединицы рибосомы.

Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН Б.26 Биологическое разнообразие (координатор акад. Д.С. Павлов)

Проект 26.21. Изучение полиморфизма генов, детерминирующих количественные признаки человека (д.б.н. Т.И. Аксенович)

Признаки, анализируемые в рамках протеомики и метаболомики, часто имеют  нерегулярное распределение, когда у части особей изучаемый метаболит не определяется, а у остальных концентрация метаболита имеет обычное нормальное распределение. Мы разработали метод и пакет программ для генетического анализа таких признаков, в основе которого лежит двухкомпонентное представление количественного признака. Для апробации метода использовали данные об одном из параметров оптического диска, VCDR, имеющем нерегулярное распределение.  На хромосоме 6 был обнаружен значимый сигнал сцепления (LOD = 3,33), тогда как стандартные методы, включающие в анализ только нормально распределенные значения, не дали значимого результата. Следовательно, разработанный нами метод позволяет повысить мощность генетического анализа.

Рис. Пример нерегулярного распределения количественного признака (а) и результаты его картирования с помощью стандартного (синий) и нового (красный) методов анализа (б).

Проект 26.22. Исследование молекулярно-генетических механизмов стрессоустойчивости на модели трансгенных растений. Оптимизация экспрессии трансгенов (к.б.н. А.В. Кочетов)

Эффективное планирование структуры генетических конструкций необходимо для оптимизации трансгенеза: необходимо, чтобы трансген экспрессировался на нужном уровне и с правильной ткане- и стадиеспецифичностью. Промотор является важной частью генетической конструкции, обеспечивающей специфичность экспрессии трансгена. Нами создан новый информационный Интернет-ресурс: база данных TGP (TransGene Promoters), формат которой позволяет проводить поиск промоторов по паттерну их экспрессии. В настоящее время в TGP собрана информация о 176 промоторах, соответствующих 94 генам 26 видов растений (рис.). Эти промоторы исследовали в экспериментах с 17 видами трансгенных растений, и для них было выявлено 36 различных факторов, влияющих на активность (гормоны, инфекция, тяжелые металлы, элиситоры, холод, засуха, засоление и т. п.). Выделено 40 различных тканей и типов клеток, для которых была показана активность ряда промоторов. Более подробное описание приведено на Интернет-сайте БД (http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/dbases/tgp/home.html).

Рис. Интернет-страница, на которой приведено содержание базы данных TGP.

Проект 26.23. Генетическое разнообразие и популяционная динамика добавочных В-хромосом млекопитающих (д.б.н. Н.Б. Рубцов)

В 2011 г. был проведен детальный анализ спаривания и рекомбинации В-хромосом и хромосом основного набора у лесных мышей. Для анализа синапсиса и рекомбинации был использован метод иммунофлюоресцентной локализации антител к белкам бокового элемента СК (SCP3), центрального элемента СК (SCP1) и белку мисматч-репарации MLH1, маркирующему сайты кроссинговера. Для выявления мейотической инактивации В- и XY-хромосом использовали метод иммунофлюоресцентной локализации антител к модифицированнуму гистону ?H2A.X.

Рис. Микрофотографии сперматоцита лесной мыши, окрашенного с использованием антител к SCP3 (а), SCP1 (б) и  ?H2A.X (в),  и объединенное изображение (г).
Установлено, что В-хромосомы лесных мышей, как В-хромосомы лисицы, вступают в синапсис, образуя разнообразные синаптические конфигурации: би- и мультиваленты. Униваленты наблюдаются довольно редко. При этом синаптические конфигурации В-хромосом часто колокализуются с XY-бивалентом на периферии профазного ядра. В этом случае на них распространяется специфичная для мейоза инактивация половых хромосом. Синаптические конфигурации В-хромосом, локализованные вне полового тельца, не вовлекаются в инактивацию. Исключение составляют униваленты В-хромосом, которые инактивируются так же, как и  неспаренные районы XY-бивалента.

 

Проект 26.24. Разнообразие структур терминальных районов хромосом млекопитающих (д.б.н. Н.С. Жданова)

Показано, что активность теломеразы в фибробластах иберийской бурозубки в полтора раза выше, чем в опухолевых клетках человека HELA. Кроме того, установлено, что в первичных фибробластах этого вида концы хромосом ассоциированы с APBs (ALT-зависимые PML тельца) тельцами, являющимися маркером альтернативного теломеразозависимому пути удлинения теломер (ALT). Данные свидетельствуют о том, что в нормальных клетках млекопитающих наряду с теломеразозависимым путем в поддержании длины теломер может участвовать альтернативный путь, основанный на гомологичной рекомбинации.

Рис. Ядра первичных фибробластов иберийской бурозубки после трансфекции плазмидой, экспрессирующей слитый с CFP (голубая окраска, б–г) мутантный белок ICPO вируса простого герпеса, накапливается в APBs. Препарат обработан поликлональными антителам кролика к RAP1 (компонент shelterin теломерного комплекса) мыши, детекция иммуноглобулинами осла коньюгированными с Alexa 488 – зеленый цвет, а–д и PNA теломерной пробой (CCCTAA)3 – Cy3 – красный цвет (А – Д).

 

Проект 26.25. Молекулярно-генетические механизмы взаимодействия гонадотропинов и биогенных аминов в контроле оогенеза насекомых (д.б.н. И.Ю. Раушенбах)

Впервые получено доказательство того, что онтогенетическое изменение направленности влияния дофамина на титр гонадотропного ювенильного гормона у самок дрозофилы обусловлено перепрограммированием тканей-мишеней (железы, синтезирующей гормон,  и жирового тела (ЖТ), синтезирующего ферменты его деградации) и изменением в них уровня экспрессии Д2-подобных рецепторов (DD2R). Впервые продемонстрировано, что перепрограммирование ЖТ осуществляется 20-гидроксиэкдизоном (20Э): 1) фармакологическое повышение уровня 20Э у молодых самок вызывает резкое снижение числа DD2R; 2) паттерн экспрессии DD2R у половозрелых виргинных самок, у которых уровень 20Э не изменяется с возрастом, соответствует паттерну молодых мух (рис.).

Рис. Число DD2R (зеленый сигнал) в клетках жирового тела у самок D. melanogaster линии Сanton S. а – 1-суточных контрольных, б – 1-суточных обработанных 20Э, в – 6-суточных оплодотворенных, 6-суточных виргинных. Синий сигнал – ядра клеток, окрашенные DAPI.

Проект 26.26. Анализ генетической детерминации интегрированных признаков организма с использованием методологии многомерной статистики и искуственных нейронных сетей. 
Поиск локусов, детерминирующих ковариацию поведения и морфологию у серебристо-черных лисиц (д.б.н. А.Л. Маркель)

На 12-й хромосоме лисицы путем микросателлитного картирования был найден локус, ассоциированный с доместикационным поведением. Гомологичный район был идентифицирован у собак как локус, вовлеченный в процесс их доместикации.

Рис. Локус на 12-й хромосоме лисиц, ответственный за формирование доместикационного поведения.

Проект 26.27. Молекулярно-генетическое изучение признаков, включенных в доместикацию у ди-, тетра- и гексаплоидных пшениц (чл.-корр. РАСХН Н.П. Гончаров)

В результате проведенного анализа обнаружено, что действительно экспрессия гена Q у мягкой пшеницы с голозерным, неспельтоидным типом колоса увеличена по сравнению с T. dicoccoides и замещенной линией CS/5A T. dicoccoides, характеризуемой пленчатостью и спельтоидным колосом(рис.). Однако у мягкой пшеницы экспрессия Q гена не превышает уровень экспрессии этого же гена у T. spelta. Поэтому в данном случае подтверждается, что контроль гена Q у двух спельтоидных форм, T. Dicoccoides и T. Spelta, осуществляется по-разному. Происхождение голозерной мягкой пшеницы от пленчатой T. dicoccoides cо спельтоидным колосом, так же как и голозерной T. sinskajae от пленчатой T. Monococcum, вполне вероятно, связано с нарушением экспрессии Q гена. В результате большее количество продукта привело к изменениям морфологии колоса. В то же время эволюция T. speltaшла независимо.На основе полученных результатов мы не можем сделать вывод, что именно описанная мутация в позиции 329 у мягкой пшеницы приводит к смене фенотипа и связана с регуляцией экспрессии и количеством продукта.

Рис. Уровень экспресии гена Q у пшениц и эгилопсов на стадии 3 листьев.

Проект 26.28. Механизмы стабилизации интрогрессивных форм мягкой пшеницы в зависимости от таксономической принадлежности источников чужеродного генетического материала (д.б.н. Л.А. Першина)
На основе ранее полученных иммунных линий сорта мягкой пшеницы Саратовская 29 созданы и изучены новые интрогрессивные формы мягкой пшеницы, сочетающие генетический материал разных дикорастущих сородичей пшеницы: 1) Triticum timopheeviiAegilops tauschiiand Triticum dicoccum;2) Triticum timopheevii,Aegilops tauschiiand Triticum dicoccoides;3)Triticum timopheevii,Aegilops tauschiiand Agropyron intermediumВыделены наиболее перспективные формы, устойчивые к бурой и стеблевой ржавчине, которые рассматриваются в качестве доноров устойчивости к грибным патогенам и будут переданы в селекционные центры. Выявлен новый ген устойчивости к бурой ржавчине (обозначен символом LrAsp5), интрогрессированный в геном мягкой пшеницы от Aegilops speltoides.

 

Рис. 1. Растения сорта мягкой пшеницы Саратовская 29, пораженные патогенами бурой и стеблевой ржавчины.

 

Рис. 2. Новая форма мягкой пшеницы Triticum aestivum, сочетающая генетический материал Triticum timopheevii,Aegilops tauschiiand Agropyron intermediumи характеризующаяся устойчивостью к бурой и стеблевой ржавчине.

Проект 26.29. Биоинформатика генетической изменчивости: исследование влияния мутаций на молекулярно-генетические системы организмов (акад. Н.А. Колчанов)

Впервые показано, что экспериментально-компьютерный анализ однонуклеотидного полиморфизма (SNP) в ТАТА-боксах генов человека, ассоциированных с различными заболеваниями (см. табл.), может составить основу тест-системы, прогнозирующей проявление патологических состояний. С помощью ранее выведенного уравнения регрессии «последовательность ДНК > аффинность к белку ТВР» проанализировано более 50 известных SNP в ТАТА-боксах генов человека. На основании полученных результатов предсказано и подтверждено в 11 экспериментах in vitro, что фенотипическое проявление этих SNP может быть связано со снижением эффективности образования комплекса TBP-TATA-бокс (табл.).

Таблица. Проверка прогнозов in silico путем экспериментальных измерений сродства TBP к TATA-боксу in vitro

11 SNP c наибольшими повреждениями ТАТА боксов

TBP/ТАТА
комплекс

Контроль, изменение от специф. до неспец. сродства ± станд. ош. 
insilico
invitro

Ген человека

Сайт связывания с TATA боксом, норма

Мутация (SNP)

Заболевание

in silico, изменение сродства ± станд. ош.

in vitro, изменениесродства ± станд. ош.

HHBb

gggctgggCATAAAAgtcaggg

-31A>g

?-талассемия

–0,6 ± 0,1

–1,7 ± 0,4*

–7,0 ± 2,3
–6,2 ± 2,3

-30T>a

–1,5 ± 0,1

–1,5 ± 0,4

-30T>c

–1,0 ± 0,1

–1,7 ± 0,4*

-29A>g

–1,2 ± 0,1

–3,2 ± 0,4*

-28A>c

–0,5 ± 0,1

–2,8 ± 0,4*

-28T>g

–0,7 ± 0,1

–1,1 ± 0,4

-27A>t

–0,4 ± 0,1

–1,1 ± 0,4*

TPI

cggcgctcТАТАТААgtgggca

-24T>g

Анемия

–1,0 ± 0,1

–3,7 ± 0,4*

–8,6 ± 2,3
–7,3 ± 2,3

MBL

tctatttcТАТАТАgcctgcac

-35T>c

Иммунодефицит

–1,1 ± 0,1

–1,7 ± 0,4*

–8,2 ± 2,3
–5,9 ± 2,3

SOD1

gtctggccТАТАААgtagtcgc

-27A>g

Склероз

–1,2 ± 0,1

–1,5 ± 0,4

–7,7 ± 2,3
–5,5 ± 2,3

P450 2A6

tcaggcagТАТАААggcaaacc

-48T>g

Рак легких

–1,5 ± 0,2

–1,6 ± 0,4

–8,4 ± 2,3
–6,4 ± 2,3

SNP-зависимое изменение TBP/ТАТА-сродства, in silico и in vitro

Факт (значимость)

Совпадение знаков для in silico и in vitro (a priori 0,50): 

1,00 (a < 0,005)

Перекрытие 95 %-интервалов для in silico и in vitro (a priori 0,05):

0,36 (a < 0,025)

Перекрытие 95 %-интервалов SNP и случайная ДНК (a priori 0,50):

0,00 (a < 0,005)

Проект 26.30. Полиморфизм природных популяций – влияние факторов внешней среды и взаимодействие генов и геномов (д.б.н. И.К. Захаров)

Впервые показано, что симбиотические бактерии Wolbachia штамм wMelPop нарушают процесс формирования яйцевых камер, что приводит к увеличению частоты апоптоза в гермарии D. melanogaster w1118. Количество гермариев с апоптозом в контрольной точке 2а/2б возрастает до 70,6 ± 5,3 % у инфицированных Wolbachia мух по сравнению с 41,8 ± 4,1 % у неинфицированных мух.

Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН Б.21 Основы фундаментальных исследований нанотехнологий и наноматериалов (координатор акад. Ж.И. Алферов)

Проект 21.63. Эллипсометрическое изучение закономерностей модуляции поверхностного плазмонного резонанса различными биологическими субстратами для разработки новых подходов к диагностике заболеваний человека (чл.-корр. РАМН М.И. Воевода)

Создан и опробован спектральный эллипсометрический ППР-комплекс для анализа процессов типа «антиген-антитело», происходящих в водных растворах биоорганических субстратов малых концентраций. Проведены пилотные эллипсометрические эксперименты по исследованию сывороток крови в условиях наблюдения поверхностного плазмонного резонанса у пациентов с опухолями кишечника. Выявлено наличие стойкого специфического взаимодействия между антигенами сывороток крови пациентов и моноклональными антителами СД24, предварительно иммобилизованными на поверхности резонансной среды (золото), которое приводит к изменению положения поверхностного плазмонного резонанса в спектре. Показано, что эллипсометрия представляет собой высокочувствительный, неразрушающий, экономичный экспресс-метод скрининга, предварительной диагностики стадий заболевания пациентов с патологией внутренних органов.

Рис. 1. Внешний вид спектрального эллипсометрического ППР-комплекса.

Рис. 2. Кинетические кривые изменения эллипсометрического угла D в процессах образования поверхностного комплекса антиген–антитело (СД24) и его распада.

Стрелками показаны моменты подачи сыворотки крови в систему и промывки системы. 1, 2 – больные с выявленной онкологией, 3 – больной с онкологией, прошедший курс химиотерапии, 4 – пациент без выявленной онкологии.

Проект 66. Исследование подавления экспрессии гена in vivo олигонуклеотидами, комплементарными к мРНК гена-мишени, иммобилизованными на наночастицах биодеградируемых полимеров радиационным способом (д.б.н. Н.Н. Дыгало)

Обнаружена функциональная токсичность – нарушение экспрессии важных для функции мозга генов, которая может быть индуцирована экзогенными фрагментами ДНК и синтетическими олигонуклеотидами, используемыми для получения нанокомплексов с полисахаридами При их введении в отделы головного мозга повышались уровни экспрессии мРНК и белка рецепторов нейротрансмиттера норадреналина, что сопровождалось проявлением двигательного беспокойства животных (рис.).

Рис. Двигательная активность 2–5-дневных крысят после введения им в головной мозг экзогенных фрагментов ДНК, используемых для получения нанокомплексов с полисахаридами. Животные с введением фрагментов ДНК проявляли достоверно большую по сравнению с контролем двигательную активность на 3–5-й дни жизни.

Критерии общей токсичности такие, как прирост массы тела, проявление моторных рефлексов, склонность к впадению в гипногенное состояние, существенно не изменялись после введения в головной мозг экзогенных фрагментов ДНК и синтетических олигонуклеотидов в дозах, эффективных для подавления экспрессии гена-мишени. Установлена относительная безопасность для жизнеспособности клеток головного мозга поступления в него экзогенных фрагментов ДНК и синтетических олигонуклеотидов. Ни фрагменты ДНК, ни синтетические олигонуклеотиды не индуцировали экспрессию ключевой протеазы программируемой гибели клеток каспазы-3 ни в коре, ни в стволовой части головного мозга.

Проект 69. Разработка фундаментальных основ определения масс наночастиц и биополимеров, недоступных современным методам  масс-спектрометрического анализа (акад. Н.А. Колчанов, к.б.н. С.Е. Пельтек)

Совместно с Институтом ядерной физики им. Г.И. Будкера СО РАН и Международным томографическим  центром СО РАН создан действующий макет время-пролетного масс-спектрометра на основе мягкой неразрушающей абляции под действием терагерцового излучения для измерения масс неорганических частиц и биополимеров. Макет разработан  на основе промышленно выпускаемого  масс-спектрометра МСХ-6 (рис.). Масс-спектрометр имеет в своем составе камеру образца, ионизационный узел с электронным ударом в 70эВ, ускоряющие сетки с общим напряжением 1500В, электростатическое зеркало с напряжением 2000В, систему детекции и вакуумную систему. 
Разработана структура базы данных точных масс водонерастворимых протеинов, полисахаридов, ДНК больших молекулярных масс и наночастиц различной природы.  Созданы словари наименований водонерастворимых протеинов, полисахаридов и наночастиц. Создана система ввода и выполнения запросов к базе данных.

Рис. Макет время-пролетного масс-спектрометра.

РЕЗУЛЬТАТЫ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ РАБОТ ПО ПРОГРАММАМ ПРЕЗИДИУМА СО РАН

Междисциплинарные интеграционные проекты Президиума СО РАН

Проект 7. Разработка генно-инженерной платформы нового поколения для  экспрессии целевых генов в составе внеядерных геномов. 
Координатор проекта д.б.н. Е.В. Дейнеко, ИЦиГ СО РАН

Отработана методика разделения микрокластеров (рис., а) для выделения GFP-позитивных протопластов методом проточной цитометрии (рис. в, г). GFP-флюоресценция суспензионной культуры трансгенных микрокластеров клеток табака и смеси одиночных протопластов представлена на рисунке (б, г – зеленый цвет). Клетки нетрансгенных микрокластеров и полученных из них протопластов характеризовались только автофлюоренсценцией хлорофилла (б, г – красный цвет). Разделение смеси протопластов, полученных из каллусных культур табака, представлено на гистограмме областью Р1, соответствующей GFP-флюоресценции. При разделении гетерогенных суспензий клеток табака методом проточной цитометрии субпопуляции GFP-позитивных (светящихся) клеток составили 18,5–29,8 %.

Рис. Получение моноклеточной суспензии для выделения GFP-позитивных протопластов методом проточной цитометрии.
а, б – микрокластеры клеток табака в суспензионной культуре; в, г – отдельные протопласты табака в суспензионной культуре; д – гистограмма распределения сигналов флюоресценции при проведении проточной цитометрии, область Р1 соответствует флюоресценции GFP, е – частота распределения сигналов GFP-флюоресценции при проведении проточной цитометрии на примере одного образца.
Обозначения: а, в – световая микроскопия; б, г – флюоресцентная микроскопия;
зеленый цвет – флюоресценция GFP; красный цвет – автофлюоресценция хлоропластов.

Проект 18. Комплексное исследование генетических, молекулярных и физиологических механизмов депрессии и разработка новых методов ее фармакологической коррекции. 
Роль наследственных изменений в цитокиновой и серотониновой системах мозга 
Координатор проекта д.м.н. Н.К. Попова, ИЦиГ СО РАН

В лаборатории нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН совместно с лабораторией биомедицинской информатики КТИВТ СО РАН было исследовано действие синтезированного в лаборатории химии природных соединений НИОХ СО РАН нового малотоксичного синтетического аналога варацина ТХ-2153 (бензопентатиепин) на поведение и судорожную активность нейронов гиппокампа. Введение препарата существенно снижало выраженность каталепсии и время депрессивноподобной  неподвижности в тесте принудительного плавания у мышей ASC (Antidepressant Sensitive Catalepsy), предлагаемой в качестве модели депрессивного состояния. Кроме того, ТХ-2153 значительно подавлял импульсную активность срезов гиппокампа. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ТХ-2153 обладает высокими антикаталептическими и антидепрессантными свойствами.

а 

б

Рис. Влияние ТХ-2153 у мышей ASC на время каталептического замирания (а) и на время неподвижности в тесте принудительного плавания (б).

Проект 58. Создание нового методического подхода для изучения регуляции и динамики процессов молекулярного переноса, определяющих водно-электролитный гомеостаз клетки
Координатор проекта д.б.н. Е.И. Соленов, ИЦиГ СО РАН

Разработан новый подход к изучению физиологических свойств клетки, который объединил современные экспериментальные биофизические методы и компьютерное моделирование исследуемых процессов. В экспериментальной части работы создан лабораторный прототип микрофлюидной системы для исследования характеристик индивидуальных клеток и их групп. Синтезированы квантовые точки нового поколения, что позволило изготовить на их основе аффинные молекулярные зонды. В теоретической части проекта на основе полученных экспериментальных данных создана  математическая модель, интегрирующая трансмембранные потоки осмолитов в клетке, а также разработаны программы для оптимизации параметров математической модели на высокопроизводительном кластере НКС-30Т. 

Проект 73. Научные основы технологии выращивания и переработки нового вида целлюлозосодержащего сырья мискантуса китайского 
Координатор проекта акад. В.К. Шумный, ИЦиГ СО РАН

Передан в государственное сортоиспытание (в виде экспертной оценки) сорт Сибиряк новой технической культуры – мискантус(веерник китайский – Miscanthus sinensis Andersson) (рис.). Возделывание данного сорта дает возможность получения дешевого возобновляемого источника растительного сырья для производства целлюлозы многоцелевого использования. Показана пригодность мискантуса для эффективного культивирования в специфических климатических и почвенных условиях Западной Сибири как источника высококачественного сырья (соломы). 


а


б


в


г

Рис. Источник целлюлозосодержащего сырья – сорт новой технической культуры веерника китайского «Сибиряк».

а, б – посадки мискантуса; в – солома (сноп); г – тюки соломы.

Проект 91. Функция почки как интегрального механизма регуляции артериального давления при артериальной гипертонии: экспериментальное исследование, математическое и компьютерное моделирование
Координаторы проекта: акад. Л.Н. Иванова, ИЦиГ СО РАН; д.ф.-м.н. А.М. Блохин, ИМ СО РАН

Разработана новая методика для неинвазивного изучения динамики кровообращения в конечностях экспериментальных животных (лабораторные крысы и мыши) с применением тепловизоров последнего поколения (рис.).
На крысах линии НИСАГ с применением нового метода показано наличие повышенной реактивности кровеносных сосудов к вазоконстрикторам (норадреналин), что может вносить существенный вклад в формирование гипертензивного статуса при стресс зависимой артериальной гипертонии.

Рис. Установка для неинвазивного изучения динамики кровообращения в конечностях экспериментальных животных. 
Проект 94
. Сигнальное и диагностическое значение летучих продуктов метаболизма 
Координатор проекта д.б.н. М.П. Мошкин, ИЦиГ СО РАН

Впервые установлено, что метаболические процессы, сопровождающие иммунную реакцию мышей на чужеродные антигены, влияют на спектр выделяемых с мочой летучих органических соединений (ЛОС). Хромато-масс-спектрометрический анализ ЛОС показал, что запуск иммунной защиты приводит к повышению продукции веществ, обладающих антибактериальным (нонаналь) и антиканцерогенным (бензотиазол) действием (рис.) Тесты ольфакторного выбора и газовая хроматография показывают, что различная иммунореактивность самцов находит отражение в их хемосигналах. Полученные в результате сотрудничества с ИНГГ СОРАН и ИК СОРАН данные подтверждают значимость выделяемых с мочой ЛОС для формирования популяционных адаптаций и для поиска новых методов оценки иммунного статуса.

Рис. Метаболические изменения на разных стадиях иммунного ответа, оцененные биотестированием и хромато-масс-спектрометрией образцов мочи мышей.

а – динамика титров IgG; б – вариации титров IgG на пике иммунного ответа как критерий для классификации на низко- (НИР) и высокореактивных (ВИР) особей; в – изменения уровней нонаналя и бензотиазола на 3-и сутки после введения антигена, представленные как сдвиг относительно исходных значений; г – дифференцирование высоко (ВИР) и низкореактивных (НИР) самцов мышей на основе исследования хемосигналов в тесте ольфакторного выбора (ось ординат) и комплексного анализа хроматографических паттернов (ось абсцисс); д – пример газовой хроматограммы паровой фазы мочи.

Проект 119. Постгеномная биоинформатика: компьютерный анализ и моделирование молекулярно-генетических систем 
Координатор проекта акад. Н.А. Колчанов, ИЦиГ СО РАН

Проведен анализ эволюции структуры генной сети клеточного цикла у животных. Показано, что в ходе эволюции происходило усложнение структуры сети за счет дупликаций вовлеченных в нее генов и изменения взаимодействий между ними (рис. 1).

Рис. 1. Усложнение структуры сети клеточного цикла в ходе эволюции животных.

а – минимальная  предковая сеть контроля клеточного цикла животных; б – сеть контроля клеточного цикла млекопитающих (гены, формирующие ядро сети включая семейства циклинов, показаны желтым фоном, их белковые продукты – розовым, регуляторная компонента сети – синим).

Анализ молекулярной эволюции циклинов, ключевых белков сети клеточного цикла, позволил выявить в их семействах A, B, E и D наборы атипичных аминокислотных замен, являющихся свидетельством адаптивной эволюции. Было показано, что такие замены значимо чаще фиксируются в поверхностных позициях белковой глобулы, на противоположной стороне от места контакта циклина с циклин-зависимой киназой (CDK) (рис. 2). Вероятно, фиксация этих замен могла обуславливать возникновение новых сайтов связывания белков в ходе эволюции животных и, тем самым, вносить важный вклад в усложнение структуры сети клеточного цикла.

Рис. 2. Трехмерная структура циклинов с локализацией консервативных и варьирующих участков вторичных структур.

а – комплекс циклин A1-CDK2 человека; б – циклин B1 человека; в – циклин B дрожжей. Знаком «+» выделены участки белка, в которых значимо преобладают атипичные замены. Красным выделены молекулы CDK, синим структурно-консервативные участки циклинов соответствующих семейств.

ИНТЕГРАЦИОННЫЕ ПРОЕКТЫ СО СТОРОННИМИ НАУЧНЫМИ ОРГАНИЗАЦИЯМИ

Проект 27. Молекулярные механизмы гормональной регуляции численности насекомых в нормальных и неблагоприятных условиях среды 
Координатор проекта д.б.н. Н.Е. Грунтенко, ИЦиГ СО РАН

Впервые продемонстрировано, что резкое снижение титра гонадотропного ювенильного гормона (ЮГ) в результате генетической абляции части клеток corpus allatum (СА) – железы, синтезирующей ЮГ, вызывает существенные изменения в метаболизме стресс-связанных гормонов, дофамина (ДА) и октопамина (ОА), и в развитии стресс-реакции. У трансгенных самок с абляцией СА: 1) снижена активность ДА-зависимой N-ацетилтрансферазы (DAT), фермента, деградирующего ДА; 2) повышен уровень ДА; 3) снижены активности щелочной фосфатазы (ЩФ), регулирующей пул предшественника ДА, и тирозингидроксилазы (ТГ), лимитирующей скорость синтеза ДА; 4) снижена активность тирозиндекарбоксилазы (ТДК), лимитирующей скорость синтеза ОА; 5) изменена интенсивность ответа ЩФ, ТГ и ТДК на  действие стрессирующего фактора.

 

Рис. Влияние генетической абляции СА (CA-ablated самки) на метаболизм гормонов стресса, дофамина и октопамина.

Обозначения: tyrosine hydroxylase – тирозингидроксилаза, alkaline phosphatase – щелочная фосфатаза, DAT – ДА-зависимая N-ацетилтрансфераза, dopamine – дофамин, tyrosine decarboxylase – тирозиндекарбоксилаза.

Проект 28. Исследование молекулярно-генетических механизмов стрессоустойчивости растений и восстановления фертильности гибридов с помощью методов хромосомной, генной и метаболической инженерии. Получение новых высокоадаптивных форм хозяйственно ценных растений 

Координаторы проекта к.б.н. А.В. Кочетов, ИЦиГ СО РАН; д.б.н. Л.А. Першина ИЦиГ СО РАН; д.б.н. В.И. Малиновский, БПИ ДВО РАН, Владивосток

Молекулярные механизмы стрессоустойчивости растений основаны на скоординированной работе сложных генных ансамблей, адаптирующих метаболические и физиологические процессы к неблагоприятным условиям. Особое значение имеют связи между генными сетями, интегрирующие ответ на стресс в единое целое. В рамках проекта исследована роль гена орнитинаминотрансферазы (ОАТ), осуществляющего конверсию орнитина в глутамат. Считалось, что ОАТ может участвовать как в метаболизме азота, так и в синтезе пролина (связанном со стрессоустойчивостью), т. е. служить связующим звеном между двумя метаболическими путями. В рамках проекта нами был проведен анализ паттерна экспрессии гена ОАТ на модели трансгенных растений. Показно, что экспрессия ОАТ важна на ранних стадиях развития (рис., а) и в точках роста (рис., б), что свидетельствует о необходимости пополнения пула свободных аминокислот в растущих тканях. По-видимому, роль ОАТ в основном связана с мобилизацией азота из резервных форм, что также может быть важно и для стресс-зависимого синтеза пролина.

Рис. Паттерн экспрессии репортерного гена бета-глюкуронидазы, расположенного под управлением промотора гена орнитинаминотрансферазы, у проростков Nicotiana tabacum.

а – экспрессия при прорастании. Цифрами обозначены дни с момента посадки семян; б – окрашенный трехнедельный проросток. Указаны части растения, в которых активен промотор гена ОАТ (им соответствует синий цвет на рисунке).

Проект 48. Регуляция пролиферативной активности и дифференцировки стволовых клеток позвоночных и беспозвоночных животных 
Координатор проекта д.б.н. О.Л. Серов, ИЦиГ СО РАН

Разработан новый метод получения стволовых герминативных клеток из яичников морских ежей S. nudus. На основании анализа базы данных морского ежа S. purpuratus(Echinodermata), плоского морского червя Platynereis dumerilii (Annelida) и мидии Crassostrea gigas (Mollusca) разработан дизайн пептида (28 ак) для получения антител против белка vasa, который является маркером созревающих ооцитов млекопитающих. Пептид входит в состав консервативного домена DEAD-box РНК хеликазы vasa. Для идентификации оогониев в яичниках и клеточных фракциях, полученных из эпителиальной ткани яичников ежей, были использованы морфологический подход, антитела на vasa-белок (рис.), а также ОТ-ПЦР для детекции экспрессии  Sp-vasa и Sp-nanos2 гомологов.

Рис. Иммунолокализация vasa-белка в яичниках и ооцитах морского ежа  Strongylocentrotus nudus

a – специфичность анти-vasa антител (Вестерн-блот анализ лизата яичников). Сигнал соответствует белку 80 kDa (пептид+), который отсутствует после его инкубации с антисывороткой (пептид-); б – часть яичника с vasa-позитивными  ооцитами (стрелки, зеленая окраска) с герминальными везикулами (звездочка). Кластеры оогониев локализованы в герминальном эпителии стенки гонады; в – оптический срез через ооциты; vasa определяется в форме гранул (зеленые точки) в цитоплазме. Маленькие герминальные клетки яичников включают мелкие (< 7 µm, г) и большие оогонии (7–9 µm, д). Формирующиеся ооциты (е) – герминальные клетки с диаметром 9–11 µm; мелкие ооциты с герминальными везикулами (отмечены звездочкой) с диаметром 12–15 µm (ж). Справа: DIC срезы тех же препаратов. Ядра герминальных и соматических клеток были визуализированы с помощью окраски пропидиумом йодидом (красная окраска). Масштабная линейка 20 µm (б, в) и 5 µm (г–ж).

 

Проект 59. Трехмерные культуры клеток: исследование культивирования стволовых и первичных клеток с целью получения дифференцированной хрящевой ткани, пригодной для заместительной терапии 
Координатор проекта д.б.н. С.М. Закиян, ИЦиГ СО РАН

Разработаны подходы использования хондропротекторных препаратов для направленной хондрогенной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток и эффективного поддержания специфического паттерна экспрессии генов в хондробластах и хрящевой ткани при длительном культивировании in vitro, которые могут найти применение при получении тканей хряща, пригодных для клинического использования в регенеративной медицине.

Рис. Влияниехондпропротекторных препаратов – глюкозамина и хондротин сульфата на направленную хондрогенную дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток и поддержание специфического паттерна экспрессии генов в хондробластах при их культивировании in vitro.

а – количественный анализ экспрессии мРНК аггрекана и коллагена 2 методом ПЦР в режиме реального времени в хондробластах, полученных при направленной дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток с использованием ростового фактора TGF-?1, глюкозамина (GL) и хондротин сульфата (CS). Аггрекан – красные столбцы, коллаген 2 – синие столбцы. По оси ординат отложен относительный уровень мРНК; б – экспрессия аггрекана (красный сигнал) в хондробластах на 21-й день культивирования в средах, содержащих и несодержащих глюкозамин (GL) и хондротин сульфат (CS).

Проект 84. Исследование репродуктивного потенциала и его гормональной регуляции у мужчин европейского и азиатского севера в связи с изменениями среды обитания 
Координатор проекта д.б.н. Л.В. Осадчук, ИЦиГ СО РАН

Эпидемиологическое исследование потенциальной фертильности и уровня основных репродуктивных гормонов у молодых мужчин (n = 983) из 5 городов РФ, отличающихся по эколого-географическому положению и национальному составу, позволило выявить существенные региональные различия в репродуктивных показателях и гормональном профиле (рис.). Установлен градиент изменения потенциальной фертильности, который характеризовался прогрессивным снижением продукции и подвижности сперматозоидов в восточном направлении, т. е. в сторону климато-экологического дискомфорта. На примере жителей городов Якутска и Улан-Удэ показано, что этнические особенности функционирования репродуктивной системы являются важным фактором, определяющим региональную гетерогенность мужской фертильности. Сравнение полученных данных с результатами исследований в европейских странах выявляет снижение потенциальных репродуктивных возможностей мужчин изученных  регионов РФ.

Рис. Межрегиональные различия в потенциальной мужской фертильности и уровне репродуктивных гормонов у жителей урбанизированных регионов РФ.

Арх – Архангельск, Кем – Кемерово, Нов – Новосибирск, У-Удэ – Улан-Удэ, Як – Якутск. ФСГ – фолликулостимулирующий гормон. Горизонтальной линией обозначены референтные значения ВОЗ (2001) для нормальной спермы.

Проект 99. Индукция эпигенетических изменений как новый эффективный метод создания исходных селекционных форм растений 
Координатор проекта проф. С.И. Малецкий, ИЦиГ СО РАН

Впервые в истории мирового земледелия  и истории селекции  у культурного растения (Beta vulgaris L. – сахарная свекла) удалось закрепить гибридную мощность («гетерозис») после двух поколений апозиготической репродукции. Уровень хозяйственной продуктивности апозиготических потомств (урожайность корней, их сахаристость и сбор сахара с гектара), полученных путем партеногенеза, равен или превосходит уровень продуктивности родительских гетерозисных гибридов (рис.). Попытки получить закрепления гибридной мощности, предпринимаемые во всем мире как у сахарной свеклы, так и у других культурных растений, за последние 70 лет не дали никаких положительных результатов ни в США, ни странах Европы, тем более в Китае и других развивающихся странах. Настоящий успех в закреплении гибридной мощности у сахарной свеклы должен открыть возможность повторения подобного результата и на других растительных объектах. 
Впервые показана возможность резкого расширения генофонда сахарной свеклы за счет прямого использования в селекции пыльцестерильных коммерческих гибридов. В настоящее время общепризнано, что это сделать невозможно.

 

Рис. Сортоиспытательные поля «Опытной научной станции по сахарной свекле Национальной академии наук Беларуси» (г. Несвиж, Республика Беларусь) в 2011 г.

Проект 112. Экспериментальный и биоинформационный анализ видообразования у млекопитающих и птиц 
Координаторы проекта д.б.н. П.М. Бородин, ИЦиГ СО РАН; акад. Ю.Н. Журавлев, БПИ ДВО РАН

Завершена реконструкция пространственно-временной динамики популяционно-генетической структуры гибридных зон млекопитающих в контексте видообразования. Установлено, что диффузия фрагментов геномов между контактирующими популяциями обыкновенной бурозубки (Sorex araneus) происходит неравномерно: часть из них остается в пределах гибридной зоны, тогда как другие распространяются далеко за ее пределы. Выявленная неравномерность диффузии указанных фрагментов определяется как генетическими (монобрахиальная гетерозиготность), так и эколого-историческими (склонность к определенным типам ландшафта, сформировавшаяся в период дивергенции) особенностями исследуемых таксономических групп. Удельный вес слабо диффундирующей части генома является оценочным показателем как степени дивергенции контактирующих популяций, так и вероятности развития этих популяций в независимые виды.

Дифференциальная диффузия фрагментов генома на примере гибридной зоны между новосибирской (Н) и томской (Т) хромосомными расами обыкновенной бурозубки. Градиент от светлого к темному цвету отражает повышение концентрации генома новосибирской расы.

а – распространение медленно диффундирующей части генома (хромосомы g-h-i-k-m-n-o-p), б – распространение быстро диффундирующей части генома (хромосомы q-r).

Проект 129. Молекулярно-генетические и цитологические основы формирования и стабилизации рекомбинантных геномов злаков 
Координаторы проекта д.б.н. Е.А. Салина, ИЦиГ СО РАН, акад. НАНБ 
Л.В. Хотылева,
 ИГиЦ НАН Беларуси

Мейоз межродовых гибридов характеризуется множественными аномалиями, что приводит к стерильности растений. Восстановление фертильности – необходимое условие первого этапа интрогрессии чужеродного хроматина в геном мягкой пшеницы. В нашей работе впервые была установлена закономерность микроспорогенеза у пшенично-ржаных амфигаплоидов ABDR (4х = 28), основанная на трех типах деления унивалентов: редукционном, эквационно+редукционном и эквационном. Первые два из трех типов  приводят к двухступенчатому мейозу («meiotic-like» – деление) и стерильности растений, последний – к одноступенчатому («mitotic-like»-делению) и частичной фертильности 
(рис. 1). Вторым механизмом фертильности является блокирование первого деления мейоза (FDR, first division restitution) (рис. 2, а); показана единовременность блокирования первого и второго делений («mitotic-like» или SDR, second division restitution) в пыльниках колосьев частично фертильных гибридов (рис. 2). Полученные результаты дают дополнительные знания об эволюции мейоза, его регуляции, цитологических механизмах полиплоидизации, а также позволяют подобрать более эффективные подходы для получения синтетических аллополиплоидов с участием мягкой пшеницы.

Рис. 1. Паттерны мейотического деления у амфигаплоидов ABDR. «Meiotic-like» деление: а – редукционный тип с образованием тетрад; б – редукционно+эквационный тип с образованием тетрад с фрагментарным хроматином;
«Mitotic-like» деление: в – эквационный тип с образованием диад и монад.

Рис. 2. Два типа мейотической реституции, приводящие к формированию диад и монад, впоследствии 2n гамет (GISH, хромосомы ржи окрашены красным).
а – FDR, хромосомы расположены по кругу кинетохорами внутрь; б – SDR, биполярная ориентация хромосом в метафазе I, хромосомы расположены на экваторе.

Проект 148. Лазерная диагностика канцерогенеза с использованием измерения преломления и флюоресцентной спектроскопии
Координатор проекта д.б.н. Т.Г. Амстиславская, ИЦиг СО РАН

Исследованы спектры лазерно-индуцированной флюоресценции различных тканей и органов, а также опухолей мышей в зависимости от длины волны возбуждения. Для облучения использовали импульсно-периодический лазер с оптопараметрической перестройкой длины волны в диапазоне 210–355 нм. Использование коротковолнового излучения позволяет наблюдать свечение флюорофоров, не возбуждающихся излучением с большей длиной волны, и благодаря этому получать новую диагностическую информацию. Использование лазера с перестраиваемой длиной волны позволяет селективно возбуждать флюорофоры – для некоторых оптимальных длин волн лазерного излучения наблюдается различие между нормальными (интактными) и опухолевыми тканями. Например, на рис. представлены спектры ЛИФ интактного легкого и легкого, пораженного опухолью LLC – при возбуждении излучением с длиной волны 250 нм наблюдается отличие в полосе 340–360 нм.

Рис. Спектр лазерно-индуцированной флюоресценции интактного легкого мыши и легкого, пораженного опухолью (длина волны возбуждающего излучения – 250 нм).

ГРАНТЫ ЭКСПЕДИЦИОННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ СО РАН

1. Сбор растительного материала для выявления альтернативных источников целлюлозы
Научный руководитель д.с-х.н. А.В. Железнов

Цель экспедиции – поиск и сбор семян растений с высоким содержанием целлюлозы. Обследовались луговые биоценозы Новосибирской, Кемеровской областей, Алтайского края, Республики Алтай. За время экспедиции собрано 118 образцов, относящихся к 22 семействам. Найдены образцы канареечника тростниковидного (Phalaris arundinaceae L), содержащие от 47,1 до 49,8 % целлюлозы, тростника обыкновенного (Phragmites communis Trin), содержащие  в зеленой массе 40 % целлюлозы. Собранный материал будет изучаться для выявления межвидовой и межпопуляционной изменчивости признака «содержание целлюлозы», а также для определения качества целлюлозы.

Рис. Естественные заросли канареечника тростниковидного, р. Томь.

2. Исследование репродуктивного потенциала мужского населения Северо-Восточного региона РФ – поиск этнических и эколого-географических различий
Научный руководитель д.б.н. Л.В. Осадчук

Андрологическое обследование мужчин (n = 247) из популяции г. Якутска выявило у 4,7 % азооспермию, у 29,5 % – олигозооспермию и у 62,8 % – астенозооспермию. По концентрации и доле подвижных сперматозоидов только 33,3 % испытуемых удовлетворяли стандартам ВОЗ (2001). Средние значения объема эякулята (3,15 ± 0,08 мл) и концентрации сперматозоидов в эякуляте (35,01 ± 1,65 млн/мл) удовлетворяли стандартам ВОЗ для нормальной спермы, однако доля подвижных сперматозоидов была ниже нормативных значений (39,19 ± 1,67 %). Установлено, что мужчины европеоидной этнической принадлежности имели больший объем семенников и эякулята по сравнению с якутами (рис.). Метисы характеризовались повышенной концентрацией и подвижностью сперматозоидов в эякуляте по сравнению с европеоидами (рис.), таким образом, метисация способствовала повышению потенциальной мужской фертильности. Исследование впервые демонстрирует у мужчин Северо-Восточного региона РФ высокую частоту субоптимального качества спермы и межэтнические различия в потенциальной мужской фертильности.

Рис. Основные параметры репродуктивного потенциала у мужчин якутской и европеоидной этнической принадлежности г. Якутска.

* Достоверные межэтнические различия; горизонтальная черта – референтные значения ВОЗ (2001); БТО – битестикулярный объем, ФСГ – фолликулостимулирующий гормон.

3. Изучение молекулярных механизмов наследственной глухоты и распространенности в популяциях Сибири
Научный руководитель к.б.н. О.Л. Посух

В период экспедиционных работ в 2011 г. в Республике Алтай (Улаганский и Кош-Агачский районы) и Республике Тыва (г. Кызыл) выполнено:
Республика Алтай: уточнены и получены дополнительные сведения и образцы крови у членов семей с нейросенсорной глухотой, у которых были выявлены мутации митохондриальной ДНК (Т1095С и А7475С), предположительно ассоциированные с потерей слуха. Секвенирование полной последовательности митДНК, проведенное у пробанда с мутацией T1095C (ген 12S RNA), а также у алтайца из контрольной выборки с этой же мутацией, свидетельствует о вероятном отсутствии ассоциации мутации Т1095С с потерей слуха, поскольку эта мутация является базовым полиморфным вариантом для восточно-азиатской митохондриальной гаплогруппы М11.
Республика Тыва: получено распределение детского населения, состоящего на сурдологопедическом учете в Республике Тыва, по типам потери слуха (рис., а) и территориально (г. Кызыл и 17 районов) (рис., б). Поскольку случаи врожденной нейросенсорной тугоухости 3–4 степени / глухоты или возникшие в раннем детском возрасте с наибольшей вероятностью обусловлены генетическими факторами, именно эта категория детей (N = 258 чел.) представляется наиболее адекватной для последующего молекулярно-генетического анализа. Сформирована выборка детей с изолированной нейросенсорной тугоухостью тяжелой степени / глухотой, обучающихся в специальной (коррекционной) общеобразовательной школе-интернате 1-го вида для неслышащих детей (г. Кызыл) и после информированного согласия родителей получены образцы крови и выделена ДНК (N = 99) для последующих молекулярно-генетических исследований. Была продолжена работа по формированию выборки взрослых лиц с потерей слуха и их родственников – сбор информации, построение родословных, сбор образцов крови и экстракция ДНК (N = 108 чел.).

Рис. а – территориальное распределение детей с различными типами потери слуха, состоящих на сурдологопедическом учете в Республике Тыва; б – сотношение типов потери слуха среди детей, состоящих на сурдологопедическом учете (суммарно).

4. Полиморфизм гена фактора некроза опухолей-альфа у пород крупного рогатого скота, выведенных в экстремальных условиях содержания 
Научный руководительк.б.н. Н.С. Юдин

В период экспедиционных работ в Экспериментальном хозяйстве СО РАН (с. Черга, Шебалинский район, Республика Алтай) произведен сбор биологического материала (образцы крови) от 48 животных серой украинской породы и 33 животных якутской породы крупного рогатого скота. Из полученных образцов путем протеолитической обработки с последующей экстракцией фенол-хлороформом выделена тотальная ДНК. Далее методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с использованием рестриктазы EcoICR I произведено генотипирование животных по однонуклеотидному полиморфизму -824A/G в промоторе гена фактора некроза опухолей альфа (ФНОа). Частота аллеля G варьировала от 48–58 % среди различных пород крупного рогатого скота до 77 % у аборигенного якутского скота и до 100 % в свободноживущей популяции зубра (Bison bonasus). Ранее нами было показано, что у гомозигот G/G, в отличие от гомозигот А/А и гетерозигот A/G, среднегодовой удой у коров почти на 1000 кг молока больше, если у них рождается бычок, чем если у них рождается телочка. У большинства млекопитающих детеныши мужского пола растут быстрее и требуют усиленного питания. По-видимому, перераспределение ресурсов в соответствии с необходимостью выкармливать теленка мужского пола у гомозигот G/G может иметь большое адаптивное значение для животных в экстремальных экологических условиях. В ходе доместикации этот признак потерял адаптивное значение и стал приводить к снижению молочной продуктивности коровы из-за значительного разброса между лактациями.

Рис. Частота аллеля G в промоторе гена ФНОа у крупного рогатого скота, 
выведенного в различных экологических условиях.

 

5. Мониторинговые исследования генофонда популяции тундровых ненцев Ямало-Ненецкого АО 
Научный руководитель к.б.н. Л.П. Осипова

В Тазовском районе Ямало-Ненецкого автономного округа выполнен сбор демографических и генеалогических данных среди коренного населения (тундровых ненцев), их метисов, а также среди пришлого населения (всего 300 чел.). Был исследован полиморфизм по антигенам групп крови ABO (A1, A2, B), Rhesus (Cw, C, c, D, E, e), Kell, MN с использованием антисывороток фирмы «Гематолог», Россия. По национальному составу почти 79 % выборки составляют ненцы и их метисы, тогда как пришлое население – около 20 %. Среди ненцев и их метисов фенотипически превалирует первая группа крови 0(I), тогда как среди пришлого населения – вторая А (II). Тот факт, что среди выборки ненцев с довольно значительной частотой встречаются «европеоидные» маркеры, такие, как А2, маркер Kell, а также резус-отрицательный фенотип ccddee, указывает на наличие европеоидной компоненты в их генофонде. В то же время присутствие почти у половины ненцев «северно-монголоидного» аллеля Ев составе резусных фенотипов четко указывает на присутствие северно-монголоидной компоненты. Требует особого внимания анализ распространения в выборке антигена Келл. В дальнейшем представляется важным сконструировать материнские и отцовские линии в тазовской группе ненцев и выполнить молекулярно-генетические исследования полиморфизма митДНК и У-хромосомы, поскольку эта группа значительно отличается от самбургской группы ненцев.

Таблица. Численности и частоты фенотипов групп крови в изученных выборках ненцев и потомков смешанных браков ненцев с представителями пришлых национальностей.

Системы групп крови

Фенотип

Ненцы

Метисы нен/пришл.**

Пришлые*

Числен-ность (196)

Частота

Числен-ность (36)

Частота

Числен-ность (60)

Частота

ABO

O(I)

81

0,413

17

0,472

13

0,216

A1(II)

43

0,219

8

0,222

22

0,367

A2(II)

5

0,026

0

0, 000

6

0,100

B(III)

52

0,265

11

0,306

14

0,233

A1B(IV)

10

0,051

0

0, 000

4

0,067

A2B(IV)

5

0,026

0

0, 000

1

0,017

Kell

K

6

0,031

0

0, 000

6

0,100

k

190

0,969

36

1,000

54

0,900

MN

M

31

0,158

3

0,083

13

0,217

N

92

0,470

12

0,333

18

0,300

MN

73

0,372

21

0,584

29

0,483

Всего

 

196

1,000

36

1,000

60

1,000

Rhesus

CCDee

66

0,34

10

0,278

9

0,150

CcDEe

68

0,351

10

0,278

11

0,183

CcDee

22

0,113

7

0,194

17

0,283

ccDEE

17

0,088

2

0,055

6

0,100

ccDEe

13

0,067

5

0,139

4

0,066

ccDee

1

0,005

0

0, 000

0

0, 000

ccddee

7

0,036

1

0,028

10

0,167

Ccdee

0

0, 000

0

0, 000

1

0,017

CCwDee и CwcDee

0

0, 000

0

0, 000

2

0,034

CwcDEe

 

0, 000

1

0,028

0

0, 000

Всего

 

194

1,000

36

1,000

60

1,000

Примечание. * Русские, украинцы, ногайцы, татары и представители других пришлых национальностей, а также потомки их браков между собой.
** Потомки смешанных браков ненцев с представителями пришлых национальностей.

6. Изучение структуры микробиологических сообществ озер Новосибирской области 
Научный руководитель к.б.н. С.Е. Пельтек

В результате экспедиционных работ были отобраны микробиологические пробы воды и донных осадков 8 соленых озер Баганского и Карасукского района Новосибирской области. Были получены данные о составе и структуре микробных сообществ исследуемых озер. С помощью метода флюоресцентной in situ гибридизации была изучена пространственно-временная организация планктонных микробных сообществ исследуемых озер и определен количественный состав архей, бактерий, цианобактерий и водорослей. Была установлена связь структуры микробных сообществ с геохимическими условиями среды обитания. В результате работы была пополнена коллекция экстремофильных микроорганизмов. Для 24 изолятов проведена сравнительная идентификация методами молекулярной биологии и масс-спектрометрии.

Рис. Фрагмент филогенетического дерева, построенного для некоторых микроорганизмов, выделенных из соленых озер Новосибирской области. 
Шкала соответствует 0,05 нуклеотидных замен на сайт.

7. Динамика биоразнообразия доместицированных растений на Главном Тавре (центре доместикации диплоидных пшениц)
Научный руководитель чл.-корр. РАСХН Н.П. Гончаров
Главная задача экспедиции – поиск и сбор семян культурных растений и их диких сородичей, выяснение границ и особенностей земледелия в горных районах центральной Турции (предгорья Главного Тавра). В период экспедиционных работ в районе Чукурова (Юго-Западная Турция) выполнен сбор данных по произрастанию диких ди- (T. urartuT. boeoticum) и тетраплоидных (T.dicoccoides) пшениц (рис.).

Рис. Дикие виды пшениц и их сородичи: а – Ae. speltoides; б – массив T. dicoccoides
в – Hordeum spontaneum; г – T. boeoticum.
В 1925 г. экспедицией ВИР под руководством профессора П.М. Жуковского был обнаружен единичный образец T. dicoccoides, который посчитали заносным. Нашей экспедицией выявлены три значительных по площади местонахождения данного вида на границе Турции с Сирией. Образцы относятся к редко встречающемуся подвиду и будут включены в филогенетический анализ с использованием молекулярно-биологических методов с целью прояснения вопросов о месте и времени доместикации тетраплоидных пшениц.

8. Геномная изменчивость и межвидовая гибридизация в диплоидных сибирских популяциях Fragaria vesca и Fragaria viridis
Научный руководитель к.б.н. С.О. Батурин

За экспедиционный период собран новый живой растительный материал в виде образцов вида Fragaria vesca (Земляника лесная) и Fragaria viridis. Образцы пополнили коллекцию дикорастущих земляник лаборатории популяционной генетики растений ИЦиГ СО РАН. Объем собранного экспедиционного растительного материала: 3 экотипа, представленные 16 растениями и семенами (Маслянинский район НСО); 1 экотип, представленный 7 растениями и семенами, в том числе ремонтантными (Кемеровская область); 2 экотипа, представленные 10 растениями и семенами (Республика Хакасия); 1 экотип Fragaria viridis, представленный 4 растениями (Республика Тыва). При исследовании  дикорастущих популяций F. vesca особое внимание уделялось образцам с морфологическими признаками полиплоидных растений.
При исследовании дикорастущих популяций F. vesca особое внимание уделялось растениям, произраставшим в экстремальных условиях: скалы, затопляемые поймы рек, галечные косы, продуваемые склоны гор и т. д. Среди произрастающих на скалах растений F. vesca (Присалаирье, Маслянинский район НСО) выделен клон земляники № 11-2 цветущий, но не образующий семян и плодов. Предварительный анализ биоморфологических признаков указывает на его гибридное межвидовое происхождение Fragaria vesca ? Fragaria viridis. За время экспедиционных сборов прошлых лет – это четвертый образец естественной межвидовой гибридизации Fragaria vesca и Fragaria viridis. Растения F. vesca и F. viridis нередко произрастают совместно, обуславливая тем самым возможность обмена генетической информацией при взаимном опылении. Для понимания роли естественных межвидовых гибридов F1 в природных фитоценозах требуется дальнейшее их изучение в условиях экспериментального участка. Все собранные образцы представляют интерес для изучения способов семенной репродукции (автогамии и/или ксеногамии), составляющих основу формообразовательного процесса сибирских видов рода Fragaria.

а 

б 

Рис. Триплоидный образец Fragaria vesca № 11-2 в естественных условиях произрастания – сосновый бор (Искитимский район НСО).
а – в цветке тычинки недоразвиты; б – произрастание триплоида (2n = 3x =21) Fragaria vesca в естественном фитоценозе (сосновый бор).

 

9. Формирование новых природных сообществ в долине реки Кинтереп после отработки месторождения золота открытым гидромеханическим способом 
Руководитель С.К. Швайковская

Название экспедиции: Детская учебно-исследовательская экспедиция лаборатории экологического воспитания ИЦиГ СО РАН
В 2011 г. экспедиционные исследования экологического состояния экосистемы реки Бердь в Присалаирье проводились по следующим направлениям:
I. Изучение видового состава продуцентов – высших растений
Берега реки на протяжении всего исследованного участка плотно заселены околоводными растениями, представленными гидрофитами, гигрофитами и частично мезофитами. Непосредственно в воде реки произрастают 13 видов – представителей гидатофитов, доминирующие среди них – Роголистник погруженный, Рдест курчавый, Кубышка желтая.В старице обнаружено 18 видов. Преобладают по численности: Роголистник погруженный, Ряска малая, Ряска тройчатая, Многокоренник обыкновенный, Водокрас обыкновенный. На двух водных объектах, реке Бердь и старице, найдено и определено 23 вида макрофитов (водных растений).
Богатое видовое разнообразие околоводной флоры указывает на выраженный процесс естественной эвтрофикации, обусловленный поступлением биогенных веществ в результате отмирания водных макрофитов. К тому же среди гидатофитов обнаружены виды, имеющие статус индикаторов чистоты воды, это Кубышка желтая, Горец земноводный и др. Различия в видовом составе растительности участков с медленно текущей водой и на перекатах оказались незначительными. Произрастание Камыша озерного по всему исследованному участку реки обильное, вероятно, он играет большую роль в закреплении каменистого грунта и создании местообитания для видов макрозообентоса. 
Степень сапробности воды в старицах определена как очень высокая, и это подтверждалось даже по внешнему виду – практически заросшие макрофитами берега реки и пойменное озеро. По проективному покрытию преобладали следующие виды: Рдест плавающий, Стрелолист обыкновенный (Sagittaria sagittifolia L.), Ряска малая (Lemma minor L.), Кубышка желтая и др. 
Размыв или эрозия береговой линии быстро текущих рек представляет серьезную проблему в плане сохранения устойчивости пресноводной экосистемы. Сильная эрозия способствует обмелению и как следствие – ускорению эвтрофикации. Природа сама выработала механизмы укрепления берегов, и основная роль в этом процессе отведена растениям. Изучение механизмов естественной рекультивации разрушающихся берегов выявило последовательную смену фитоценозов на этих участках, т. е. сукцессионные преобразования. Выявлено, что основным абиотическим фактором, влияющим на характер  распределения растений пионеров по берегу, является состав осадочных пород.
В ходе экспедиции были найдены и определены 5 видов ив: Ива прутовидная (Salix viminalis), Ива трехтычинковая (Salix triandra), Ива белая (Salix alba), Ива Бебба (Salix bebbiana), Ива ложнопятитычинковая (Salix pseudopentandra). Причем первые 3 вида характерны, в то время как 2 последних вида нетипичны (было найдено всего несколько экземпляров данных видов). В ходе исследований очередной раз подтверждено расселение ивы при помощи бобров. Бобровые срезы ивы (в рацион бобра входят ивы), попадая в воду, пускают корни, прибитые к берегу, они укореняются и пускают побеги. Часто с этого и начинается формирование ивового ценоза на песчаных косах, обрывах (были найдены образцы как Ивы прутовидной так и Ивы трехтычинковой).
II. Изучение гидробионтов
Исследование фауны проводилось на всех трофических уровнях: макрозообентос,  птицы, млекопитающие. Изучение макрозообентоса дает нам представление о пищевых ресурсах как условия существования большого видового разнообразия более крупных животных, например рыб. Анализ видового состава и плотности отдельных видов макрозообентоса позволил сделать заключение о большом видовом разнообразии и, следовательно, устойчивости экосистемы. За время экспедиции выявлено всего 19 видов ручейников, из них 6 видов встречались только в небольших холодных ручьях, питающих р. Бердь. Доминантным видом для реки и ручьев-притоков следует считать Rhyacophila subovata. Наличие большого разнообразия фауны ручейников позволяет оценить воду на обследованных участках двух рек как чистую (олигосапробную). В результате изучения учетных площадок на исследуемом участке реки Бердь, было обнаружено и определено 58 видов представителей макрозообентосных организмов. Анализируя видовой состав по методикам Николаева и литореофил, можно сделать вывод, что сапробность воды в  реке Бердь находится между 2-м и 3-м классами (? – мезосопробная), т. е. между чистой и умеренно загрязненной. 
Биоразнообразие малакофауны представлено 10 видами моллюсков, из них брюхоногих – 9 видов, двустворчатых – 2 вида. Из двустворчатых Беззубка лебединая(Anodonta cygnaeaL.) распространена повсеместно в реке Бердь. 
III. Околоводная фауна
Практически в каждом маршрутном обследовании вдоль берега обнаруживались признаки обитания в данной местности бобра. Это были многочисленные погрызы стволов деревьев, ветки ивы с листьями, следы. Целенаправленные попытки найти характерные хатки не увенчались успехом, из чего следует, что бобры роют норы, у которых вход и выход располагаются под берегом в воде. Признаки их активной деятельности находили в изобилии – заготовка веток, следы на песке, тропы от воды к «лесозаготовочной» площадке и т. д. Вряд ли деятельность бобров на исследованном участке имеет какое-либо значение для регуляции уровня воды в реке. Ширина реки в этих местах колеблется от 7 до 25 м и глубина 1,5–2,5 м без наличия плотин в этих местах. Скорее, они важны как компонент биоразнообразия экосистемы. 
В надпойменной террасе отмечены многочисленные поселения сурка обыкновенного, кроме того. 
Из земноводных отмечены Лягушка остромордая (Rana arvalis N.) (пойма реки)  и обыкновенная жаба (Bufo bufo L.) (старицы). Пресмыкающиеся представлены прыткой ящерицей (Lacerta agilis) и гадюкой обыкновенной (Vipera berus) – вдоль кромки берега и на скалах в большом количестве (контрастный черно-серый цвет тела).
Орнитофауна представлена 61 видом птиц. Обнаруженные птицы относятся к 12 отрядам и 28 семействам. На изученной территории было обнаружено 8 видов птиц отрядаFalconiformes (Дневные хищные птицы), из них один занесен в Красные книги МСОП и РФ – Aquila clanga – Большой подорлик. Также следует отметить серого журавля (семья из 4 птиц), сороку обыкновенную, серую ворону, черного коршуна (две пары), зимородока, ласточку-береговушку, большого пестрого дятла, кулика, малого пестрого дятла.  
            III. Механизмы самоочищения экосистемы
Важным компонентом биоценоза реки являются насекомые, обитающие в непосредственной близости к воде, но не являющиеся при этом водными. Особое значение имеют насекомые, осуществляющие санитарные функции: некрофаги, копрофаги, детритофаги и др. Эти насекомые, а также представители класса Птиц с подобными функциями играют основную роль в осуществлении экосистемой функции самоочищения. Исследование состояния этой функции дает основание считать ее полноценной. Основную роль санитаров экосистемы выполняют членистоногие класса Насекомые (Insecta), доминирующими из них являются Могильщик рыжебулавый (Nicrophorus vespillo L.), Мертвоед ребристый (Silpha carinata Hbst) и Падальные мухи (Calliphoridae). Черный коршун (Milvus korschun) выполняет в данной экосистеме роль активного санитара, уничтожая трупы мелких животных и птиц не только вдоль береговой линии (рыба, принесенные течением трупы животных), но и на территориях, удаленных от воды (мелкие грызуны, млекопитающие). Абиотические факторы (быстрое течение), ускоряют процесс самоочищения путем механического разрушения тканей органических останков в воде, а низкая температура (16–17 °С) не способствует активной деятельности бактерий – деструкторов. Окончательная деструкция происходит благодаря деятельности макрозообентоса.

Функция самоочищения выполняется в данной экосистеме полноценно, так как в ней представлено широкое видовое разнообразие организмов-редуцентов, которые полностью справляются с функцией очищения экосистемы от органических останков.
Среди особо опасных вредителей леса по-прежнему отмечаются черный сосновый усач – Monochamus galloprovincialis Oll., рогохвост еловый  и  малый сосновый лубоед(Blastophagus minor Hart.). По обилию различных видов дятлов и удовлетворительному состоянию сосновых участков есть основания считать, что численность вредителей сосны находится под контролем. Таким образом, эти данные  позволяют судить о полноценной саморегуляции изучаемой экосистемы. 
По результатам  исследования биоразнообразия на основных трофических уровнях лотической экосистемы реки Бердь в предтаежной зоне Присалаирья можно констатировать устойчивое функционирование исследованной экосистемы. Функции самоочищения и саморегуляции реализуются полноценно. Анализ сапробности воды по биоиндикаторным видам макрозообентоса дает основание оценить состояние воды в реке Бердь как умеренно загрязненное, причем загрязнение естественного характера, происходящее в результате эвтрофикации реки. Экологическое состояние обследованного участка реки хорошее.

Рис. 1. Отчет члена учебно-исследовательского отряда о результатах исследовательского проекта.

Рис. 2. Определение до вида образцов пробы бентосных организмов реки Бердь при помощи бинокулярного стереоскопического микроскопа в полевых условиях.

ГРАНТЫ ЛАВРЕНТЬЕВСКОГО КОНКУРСА МОЛОДЕЖНЫХ ПРОЕКТОВ СО РАН

1. Проект «Развитие технологии получения индуцированных стволовых клеток человека, пригодных для клеточной и генной терапии»
Руководитель к.б.н. С.П. Медведев

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) имеют широкие перспективы применения в клеточной терапии, токсикологических и фармакологических исследованиях. Основной целью данного проекта была разработка высокоэффективных технологий получения ИПСК человека без генетической модификации геномов клеток. В ходе выполнения проекта мы провели временную трансфекцию фетальных нейральных стволовых клеток (ФНСК) человека полицистронным пламидным вектором, несущим гены Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc мыши, и плазмидой, экспрессирующей ген OCT4 человека. В результате были получены ИПСК, которые экспрессируют маркеры OCT4, NANOG, SSEA4, TRA-1-81 и TRA-1-60, имеют паттерн экспрессии генов, сходный с ЭСК человека, и дифференцируются in vitro в производные всех трех зародышевых листков. Кроме того, было обнаружено, что репрограммирование ФНСК, имеющих набор половых хромосом ХХ, не сопровождается эпигенетической реактивацией неактивной Х-хромосомы.  Показано, что полноценные ИПСК человека можно получить из ФНСК с помощью временной сверхэкспрессии гена OCT4 без интеграции плазмидной ДНК в геном клетки. НСК могут служить удобным инструментом для исследования молекулярных основ плюрипотентности клеток, так как могут быть репрограммированы с помощью разных наборов генов (от четырех до одного). Кроме того, в рамках данного проекта были получены полицистронные плазмидные конструкции, предназначенные для высокоэффективного репрограммирования соматических клеток человека без генетической модификации их генома.

Рис. Иммуноцитохимический анализ клеток, полученных в результате дифференцировки ИПСК in vitro.

Синий цвет – окраска ядер клеток красителем DAPI, зеленый цвет – окраска клеток с помощью антител к коллагену I (а), ?-III-тубулину (б), фибронектину (в), цитокератину 18 (г), транскрипционному фактору GATA6 (д) и нестину (е). Иммуноцитохимический анализ показал, что полученные в результате выполнения проекта ИПСК являются плюрипотентными, т. е. способны дифференцироваться в производные всех трех примитивных зародышевых листков.

2. Проект «Экспериментально-компьютерное исследование генов, участвующих в ответе макрофага на обработку диоксином, и выявление механизмов их активации»
Руководитель к.б.н. Д.Ю. Ощепков

Одним из наиболее распространенных ксенобиотиков, относящихся к иммунотоксикантам (веществам, которые в минимальных дозах нарушают иммунные реакции организма), является 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксин (далее – диоксин). Проведено комплексное экспериментально-компьютерное исследование генов, вовлекаемых в ответ макрофага – важнейшего элемента клеточного иммунного ответа – на диоксин. На основании анализа реконструированной генной сети активации макрофагов выявлены гены цитокинов, секретируемых макрофагом, и генов, воздействующих на их экспрессию транскрипционных факторов (ТФ). В промоторных областях этих генов выявлены Dioxin Responsive Elements (DRE), их проверка методом задержки в геле на предмет связывания с комплексом диоксин:AhR:ARNT позволила выявить потенциальные гены-мишени этого транскрипционного комплекса. Экспериментальный анализ экспрессии генов-мишеней на уровне мРНК методом ПЦР в реальном времени, проведенный на макрофагальной клеточной линии U937 в ответ на воздействие диоксина в концентрации 2nM, показал наличие функционально активных  DRE, расположенных в регуляторных районах генов транскрипционного фактора IRF1, субъединицы транскрипционного фактора NF-kB – RelA и субъединицы интерлейкина-12, IL12A. Также в этих условиях впервые показано увеличение экспрессии гена IL4 как на уровне мРНК (в 2 раза через 2 ч), так и на уровне белка методом ELISA (в 2,3 раза через 4,5 ч) с дальнейшим падением уровня экспрессии белка ниже контрольного через 6 часов.

Рис. Эффект воздействия 2nM концентрации диоксина на экспрессию генов в клетках макрофагов клеточной линии U937.

K – контроль, относительное количество мРНК в интактных клетках.
* Характерное время транслокации комплекса диоксин:AhR:ARNT в ядро после воздействия 2,3,7,8 –ТХДД (диоксина); ** CYP1A1 – ген, содержащий в своем энхансере 5 функциональных DRE, используется как контроль. Показано значительное увеличение экспрессии этого гена после воздействия 2,3,7,8 –ТХДД (диоксина), в том числе и в клеточной линии U937.

3. Проект «Серотониновая и цитокиновая системы мозга в регуляции депрессивноподобного поведения»
Руководитель к.б.н. М.А. Тихонова

На модели депрессивноподобного состояния, вызванного введением активатора цитокиновых каскадов липополисахарида (ЛПС), был проведен фармакологический анализ вовлечения серотонергических механизмов в регуляцию гигиенического поведения. Было показано, что активация серотониновых рецепторов 5-HT1A или 5-HT2A/2C подтипов селективными агонистами снижает эффективность гигиенической очистки шерсти у мышей. Снижение гигиенической очистки под действием ЛПС было усилено активацией 5-HT1A рецепторов. Этот результат может иметь практическую значимость, так как агонисты 5-HT1A рецепторов являются широко используемыми анксиолитиками и антидепрессантами, и их применение на фоне болезненного состояния может привести к усилению некоторых его проявлений.

Рис.Влияние ЛПС и лигандов серотониновых рецепторов (DOI (агонист 5-HT2A/2C), 8-OH-DPAT (агонист 5-HT1A), p-MPPI (селективный антагонист 5-HT1A) на эффективность гигиенической очистки шерсти у мышей линии C57BL/6.
* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001по сравнению с физ. р-ром; # < 0,05 по сравнению с ЛПС;$ p < 0,05 по сравнению с 8-OH-DPAT; @ p < 0,05 по сравнению с p-MPPI.

4. Проект «Изменение транскрипционной активности генов злаков в условиях абиотического стресса»
Руководитель к.б.н. Е.К. Хлесткина

Проведена сравнительная оценка уровня антоцианов в колеоптиле пшеницы и транскрипции гена, кодирующего флаванон-3-гидроксилазу (F3H), в колеоптиле в контрольных и стрессовых условиях (воздействие малыми дозами ионизирующего излучения, повышенными концентрациями солей, ионами тяжелых металлов), а также сравнительный анализ в условиях стресса линий, несущих контрастные аллели в локусах, детерминирующих антоциановую окраску. 
Выявлено значимое увеличение содержания антоцианов в колеоптиле при солевом стрессе (рис.) и при обработке ионами тяжелых металлов. Показано, что гены Rc и Рр пшеницы, контролирующие биосинтез антоцианов в колеоптиле и перикарпе зерна соответственно, имеют значение для неспецифической адаптации в условиях абиотического стресса.

 

Рис. Cодержание антоцианов в колеоптиле изогенных линий при обработке растений NaCl.

* Значимые отличия в содержании антоцианов при ? 0,05 (U-test) при солевом стрессе по сравнению с контролем (0 mM). * Значимые отличия в содержании антоцианов при ? 0,05 (U-test) между S29 и i:S29Pp1Pp2. Внизу – экстракты антоцианов из колеоптиле в растворе метанола/1%HCl.

ПРОГРАММА ПРЕЗИДИУМА СО РАН ПОДДЕРЖКИ ВИВАРИЕВ, КОЛЛЕКЦИЙ КЛЕТОЧНЫХ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР

Сделан первый шаг на пути к выполнению основной миссии Центра генетических ресурсов, которая заключается в обеспечении свободного доступа российских ученых к международным источникам генетического разнообразия модельных организмов. Коллекция ЦКП «SPFвиварий ИЦиГ СО РАН» пополнилась тремя инбредными линиями мышей (рис.), которые впервые получены по официальным каналам из Джексоновской лаборатории (США) и Европейского филиала компании Charles River (Германия). Эти линии широко применяются в мировой науке при изучении проблем иммунодефицита, канцерогенеза, метаболического синдрома и др. 
На основе протонной ЯМР-спектроскопии получены данные, характеризующие особенности метаболомных спектров в структурах головного мозга различающихся по поведению генетических линий животных. В частности, установлено, что селекция серых крыс на дружелюбное (ручные) или агрессивное отношение к человеку сочетается с формированием статистически значимых различий по содержанию в гиппокампе ряда аминокислот, играющих существенную роль в регуляции активности нейронов. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности прижизненной ЯМР спектроскопии в изучении молекулярно-генетических механизмов девиаций поведения и в поиске средств фармакологической и диетической коррекции.

Рис.ЦКП SPF-виварий ИЦиГ СО РАН – источник генетического разнообразия лабораторных животных и лабораторный комплекс для высокотехнологического фенотипирования.
Левая панель – линии мышей, впервые завезенные в Россию.
Правая панель – исследование метаболитов головного мозга методом протонной ЯМР спектроскопии.

 

Средства, выделенные институту Президиумом СО РАН по «Программе поддержки вивариев, коллекций клеточных и бактериальных культур», были направлены на обеспечение работ по содержанию животных в Центрах коллективного пользования (ЦКП) ИЦиГ СО РАН:

  • ЦКП «Генофонды пушных и сельскохозяйственных животных»;

  • ЦКП «Виварий конвенциональных (не SPF статуса) животных»

Интернет-адреса, по которым размещена информация о ЦКП:

http://www.bionet.nsc.ru/labs/viv/index.php?id=132
Работа в ЦКП обеспечивала исследования ИЦиГ СО РАН и ряда других институтов и университетов в области генетики животных, физиологической генетики, молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии, фармакологии и биобезопасности. На основе ресурсов ЦКП лабораториями ИЦиГ СО РАН были выполнены исследования по 22 научным проектам, поддержанным грантами РФФИ, президента РФ, Минобрнауки, Президиума СО РАН, международных фондов.

1.1. ЦКП «Генофонды пушных и сельскохозяйственных животных»

На звероферме «Каинка» в 2011 г. содержали:

  • Серебристо-черных лисиц - 851 животное основного поголовья и 2160 голов молодняка;

  • норок различных поведенческих и оригинальных окрасочных форм - 1368 голов;

  • свиней – 160 особей, из них: 20 – основное поголовье, 10 – ремонтное стадо, 6 – хряков, 124 – молодняк.

Наряду с постоянной племенной и селекционной работой, исследования, выполненные в 2011 г. на базе ЦКП «Генофонды пушных и сельскохозяйственных животных», позволили получить ряд новых научных, научно-практических и научно-образовательных результатов, которые послужили экспериментальным материалом для опубликованных статей. Некоторые наиболее интересные результаты представлены ниже.
1.1.1. Серебристо-черная лисица
Ручные лисицы, которые были получены в ходе доместикационной селекции, начатой по инициативе академика Д.К. Беляева, являются уникальным экспериментальным объектом для изучения эволюционных процессов. В отчетный период сделан очередной важный шаг к расшифровке генетических механизмов доместикационной селекции, а именно, на 12 хромосоме, с использованием методов  гибридологического анализа и геномики, выделены генетические локусы, ответственные за поведенческие и морфологические преобразования, наблюдаемые в процессе одомашнивания лисиц..
1.1.2. Американская норка
Наряду с развитием доместикационной селекции и созданием на этой основе новых окрасочных форм, в исследованиях на американской норке (Mustela vison Schreber, 1777) впервые установлено, что в отбор на неагрессивное отношение к человеку вовлекаются механизмы гемопоэза (рис. 2). Это проявляется в снижение числа клеток белой и красной крови пропорционально баллу доместикации, рассчитанному путем суммирования поведенческих и морфологических (окраска) критериев селекции. Таким образом, в процессе одомашнивания утрачиваются не только защитные формы поведения и маскирующая окраска, но и редуцируются биоэнергетические резервы организма и механизмы защиты от инфекций. Полученные результаты вносят вклад в развитие современных представлений об этолого-эволюционном синдроме, направляющим процессы естественного и искусственного отбора, а также задают новый вектор поиска генов, вовлеченных в доместикационную селекцию.

Рис. 2.  Разнообразие окрасочных форм американской норки (слева), полученных в ходе доместикационной селекции в ИЦиГ СО РАН, и сопряженная с показателями доместкации изменчивость клеток красной и белой крови (справа).
Внизу под графиком показаны крайние варианты показателей поведения и окраски агрессивных (слева) и ручных (справа) животных, на основе которых построена шкала доместикации.

1.1.3. Мини-свиньи
Впервые в мировой практике показана возможность получения жизнеспособных лабораторных свиней с живой массой при рождении 400–500 граммов. К 6-ти месячному возрасту они вырастают до 10–20 кг (рис. 3А) и способны давать потомство уже на первом году жизни. Практическая значимость таких животных определяется, прежде всего, международными регламентами доклинических испытаний, которые предписывают проверять любые средства лечения болезней не только на грызунах, но и на млекопитающих иной таксономической принадлежности.

Рис. 3. А. Рекордный образец миниатюризации – поросенок Фундук, полученный путем скрещиваний и селекции свиней мясной породы ландрас и вьетнамских свиней.
Б. Пересадка в область поврежденного позвонка (красная стрелка) хондотрансплантанта, приготовленного из культуры хондробластов хрящевой ткани тел позвонков мини-поросенка, приводит к постепенному (2-25 недели) замещению дефекта органоспецифической костной тканью (ИЦиГ СО РАН, НИИТО).

В текущем году мини-свиньи были использованы при выполнении 5-ти научных и научно образовательных проектов:

  • при изучении, совместно с НИИТО, возможностей применения хондотрансплантата для межвидовой репаративной регенерации костной ткани (Рис.3);

  • при оценке эффективности применения циркониевых биокерамических имплантантов для стоматологического протезирования (совместно с НГМУ);

  • в биоиспытаниях новых препаратов антивирусной профилактики (совместно с ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»);

  • новое направление, получившее реальное развитие в 2011 г, связано с использованием мини-свиней в научно-образовательных целях, в частности при подготовке хирургов. В проведении учебных операций под руководством ведущих хирургов Новосибирской области приняли участие студенты и преподаватели НМГУ и НГАУ(рис. 4, Б-Г).

  • 1.2. ЦКП «Виварий животных не SPF статуса (конвенциональные мыши, крысы, дикие виды грызунов)»

В 2011 г. численность экспериментальных животных, содержащихся в виварии конвенциональных животных ИЦиГ СО РАН, составляла более 18000 мелких млекопитающих разных видов, в том числе: лабораторные мыши 19-ти линий и стоков – более 14000 голов; лабораторные крысы 7 линий – 3390 голов; популяция серых крыс – 400 голов; два вида полевок рода Microtus – 290 голов; три вида хомячков – сирийские (100 гол.), джунгарские (100 гол.), Кэмпбелла (150 гол.);  обыкновенные слепушонки (50 гол).
Работы, которые были выполнены на базе ЦКП «Виварий конвенциональных животных», составилиболее 25 % от общего числа публикаций ИЦиГ СО РАН. Среди них несомненный научный интерес представляют экспериментальные модели патологий человека (рис. 5 А, Б).  В частности, созданные в ИЦиГ СО РАН крысы с наследственной стресс-индуцированной гипертензией – линия НИСАГ –  исключительно ценные модельные животные для изучения молекулярно-генетических механизмов сердечно-сосудистой патологии. В текущем году установлено, что предрасположенность к стресс-индуцированной гипертензии формируется при участии генов, контролирующих синтез «гормона тревоги» - норадреналина. У крыс линии НИСАГ повышена, по сравнению с нормотензивными животными линии WAG, экспрессия ключевого фермента биосинтеза норадреналина – тирозингидроксилазы (рис. 5 Б).
На популяции доместицированных серых крыс с помощью 200 микросателлитов идентифицированы два локуса, ответственные за спокойное по отношению к человеку поведение. Эти локусы включают также гены, контролирующие массу надпочечников и другие поведенческие признаки. Установлено, что снижение агрессивности серых крыс при доместикации связано с усилением экспрессии глюкокортикоидных рецепторов в отделах мозга (гиппокамп), что приводит к усилению отрицательной обратной связи в системе регуляции стресса (рис. 5 Г).

Рис. 5. А. Генетические линии, полученные в ИЦиГ СО РАН путем селекции аутбредных крыс Wistar по фенотипическим проявлениям патологии и поддерживаемые в  виварии  конвенциональных животных: крысы OXYS -  модель  преждевременного старения; крысы ГК – наследственная предрасположенность к катотонической реакции, как модель нарушений психики; линии НИСАГ и НИСАГ color – модель артериальной гипертензии.
Б. Различия в экспрессии гена тирозингидроксилазы в разных отделах мозга между гипертензивными (линия НИСАГ) и нормотензивными (линия WAG) крысами.
В. Ручные и агрессивные крысы, родоначальниками которых послужили дикие серые крысы, Rattus norvegicus (пасюки). 
Г. Отделы мозга, в которых у ручных крыс увеличена экспрессия глюкокортикоидных рецепторов, приводящая к повышению чувствительности механизмов отрицательной обратной связи.
Возможности выполнения селекционных работ на основе диких млекопитающих и аутбредных конвенциональных животных вносят весомый вклад в развитие генетико-эволюционных исследований и в моделирование патологий человека. Новый вектор в развитии лабораторного животноводства связан с использованием в качестве модельных объектов фундаментальной биологии и биомедицины диких млекопитающих с уникальными особенностями видовой экологии. К ним относится обыкновенная слепушонка, Ellobius talpinus, которая привлекает внимание ученых как объект геронтологии. Еще одно уникальное свойство этого норного млекопитающего заключается в том, что обыкновенная слепушонка является видом, адаптированным к интенсивной работе в условиях высокой концентрации пылевых частиц. Интерес к изучению природных адаптаций к вдыханию пыли возрастает в последнее время в связи с решением проблем нанобиобезопасности, среди которых воздействие наноразмерных твердых частиц на верхние дыхательные пути занимает ключевое место.
Предварительные результаты сравнительного исследования морфологии верхних дыхательных путей лабораторных мышей и обыкновенной слепушонки, выполненные совместно с ИТПМ СО РАН и МТЦ СО РАН, выявили значительные межвидовые различия в геометрии носовой полости. В частности, соотношение сечений носовых ходов на входе и в области максимального расширения полостей составили у лабораторных мышей – 1/4, у обыкновенной слепушонки – 1/20 (рис. 6). Для количественной оценки защитной функции видоспецифической морфологии начато численное моделирование газовой динамики верхних дыхательных путей мыши и обыкновенной слепушонки. Это позволят предсказать эффективность осаждения вдыхаемых частиц в зависимости от их размера. Далее планируется исследовать видовые особенности реакции мукозального иммунитета легких на ингаляцию наночастиц различной природы. При развитии этих работ есть высокая вероятность получить мировой приоритет в расширении списка модельных видов млекопитающих. В данном случае обыкновенная слепушонка, обитающая в 50 км к югу от Новосибирского научного центра СО РАН, может стать объектом для изучения биофизических, молекулярно-генетических и иммунофизиологических механизмов природных адаптаций к обитанию в среде с высоким содержанием пыли.

Рис. 6. Магнитно-резонансная томография (BioSpec, Bruker) носовых ходов лабораторной мыши и обыкновенной слепушонки. Для каждого вида даны площади поперечного сечения на входе в носовую полость и в области максимального расширения носовых ходов. На одном из аксиальных срезов носовых ходов обыкновенной слепушонки стрелкой показано скопление жидкости, что указывает на возможность функционирования носа по принципу пылесоса с водяным фильтром (ИЦиГ СО РАН, ИТПМ СО РАН, МТЦ СО РАН).

ПРОГРАММА ПРЕЗИДИУМА СО РАН «ПОДДЕРЖКА ПОЛЕВЫХ СТАЦИОНАРОВ (СТАНЦИЙ) ИНСТИТУТОВ СО РАН»

  1. В части выполнения одной из задач Стационара в с .Черга Республики Алтай на базе Алтайского экспериментального сельского хозяйства СО РАН по сохранению и изучению  генофонда диких видов животных (беловежский зубр – Bison bonasus L.) совместно со специалистами АЭСХ СО РАН продолжены работы по изучению биологии зубра и структуры стада. В настоящее время стадо зубров в питомнике составляет 44 особи, среди которых 17 быков и 27 коров. Численность стада приблизилась к предельной величине для существующих парков (470 га) при нормативной плотности одна особь/10 га.
    Наиболее значимым научным результатом 2001 года следует считать исследование полиморфизма  гена фактора некроза опухолей-альфа крупного рогатого скота (генотипирование животных по однонуклеотидному полиморфизму -824A/G в промоторе гена фактора некроза опухолей альфа). Частота аллеля G варьировала от 48-58% среди различных пород крупного рогатого скота до 77% у аборигенного якутского скота и до 100% в свободноживущей популяции зубра (Bison bonasus). По-видимому,  гомозиготное состояние гена G/G имеет адаптивное значение для животных в экстремальных экологических условиях.

  2. Продолжено обследование лиственничного пояса Горного Алтая как ареала распространения трутовых грибов, в частности трутовика лакированного Ganoderma lucidum(Basidiomiceta). Для молекулярно-филогенетического анализ популяций Ganoderma lucidum) проведен нализ ITS1 района рибосомального кластера 18-S-5.8S-28S в этих популяциях, а также  других базидиомицетов. Для секвенирования взят район рибосомального кластера (рис.1)

Рис. 1. Структура рибосомального кластера и праймеры для амплификации фрагментов.

 

Построено филогенетическое древо видов комплекса гриба Ganoderma lucidum, реконструированное на основе данных о нуклеотидных последовательностях ITS1  кластера рибосомальнух генов методом соединения ближайших соседей.
Образцы Ganoderma lucidum Горного Алтая представляют собой отдельную компактную группу. Отсутствие полиморфизма указывают на ее недавнее распространение в лиственничном поясе (не более 100 лет).

Рис. 2. Филогенетическое древо видов гриба Ganoderma lucidum.

 

Заказной интеграционный проект СО РАН №1 «Создание программной среды для институтов СО РАН на базе свободно распространяемого ПО и программного обеспечения с открытым исходным кодом в качестве составной части национальной программной платформы» 
Совместный проект ИМ СО РАН, ИВМиМГ СО РАН, ИСИ СО РАН, ИЦиГ СО РАН

Создан специализированный Web-портал для дистанционного обучения использованию программными и информационными ресурсами при решении задач биоинформатики. В качестве инструментального средства использовался Red5 – потоковый Flash-медиасервер  с  открытым исходным ходом, реализованный на Java. Сформирована библиотека обучающих видео-курсов, представленных в формате fvl, позволяющем просматривать видеозаписи лекций с использованием Web браузера в видео-потоке. В настоящее время библиотека обучающих курсов включает более 70 видео лекций по биоинформатике.

Рис. Скриншот интерфейса специализированного портала для поддержки дистанционного обучения по пользованию программными и информационными ресурсами при решении задач биоинформатики. Лекция профессора Акинори Сараи.