2010 год

Важнейшие результаты 2010 год

Приоритетное направление VI.45. Общая генетика.

Программа VI.45.1. Генетические основы эволюции и селекции. Реконструкция и модификация геномов методами хромосомной и генной инженерии (координатор академик РАН В.К. Шумный). Программа СО РАН VI.45.1.1.

Особенности взаимодействия генетических и средовых факторов в формировании фенотипов человека в Северной Азии (координатор чл.-корр. РАМН М.И. Воевода).

Совместно с ИАиЭТ СО РАН проведены исследования по изучению митохондриальной ДНК (мтДНК) археологических культур IV тыс. до н. э.–начала I тыс. н. э. Установлено доминирование западно-евразийских гаплотипов в образцах мтДНК от представителей из разновременных этнокультурных групп на территории Горного Алтая. Западно-евразийские гаплотипы мтДНК из палеоантропологических образцов Горного Алтая присутствуют во всех современных популяциях севера Евразии. Максимальное присутствие древних западно-евразийских гаплотипов Горного Алтая у селькупов (46 %) и кетов (47 %) подтверждает гипотезу об их южносибирском происхождении. В последнем тысячелетии до н.э. обнаружено резкое возрастание доли восточно-евразийских гаплотипов среди современных популяций, свидетельствующее о миграционных процессах.

Рис. Кардинальные изменения генетического разнообразия мтДНК населения Алтая. Латинскими буквами обозначены гаплогруппы мтДНК. Сочетание замен нуклеотидов в позициях мтДНК (гаплотип) дано в скобках. Сине-зеленые тона – западноевразийские гаплотипы, желто-красные – восточноевразийские гаплотипы. Римские цифры обозначают диапазон времени. I – разнообразие мтДНК до начала I тыс. до н. э.; II – с X в. до н. э. – I в. н. э.; III – разнообразие мтДНК современного населения Алтая.

Приоритетное направление РАН VI.45.; Программа СО РАН VI.45.1.2. Генофонды и генетическое разнообразие природных и экспериментальных популяций (координатор д.б.н. И.К. Захаров).

Проведена оценка локализации и частот фиксированных инверсионных разрывов в геномах 115 видов рода Chironomus из двух цитокомплексов (pseudothummi и thummi), отличающихся наличием реципрокных транслокаций целых плеч в двух хромосомах. Выявлено 228 точек инверсионных разрывов, которые могут быть разделены на три категории согласно частоте их встречаемости: 1) точки разрывов, имеющие высокую частоту в обоих цитокомлексах и отражающие локализацию границ космополитных инверсий, лежавших в основе эволюции всего рода Chironomus; 2) общие для обоих цитокомплексов точки разрывов, имеющие невысокую частоту; 3) специфические для каждого из цитокомплексов точки разрывов, отражающие различия в эволюции геномов в каждом из цитокомлексов. Показано, что наличие в цитокомплексах разных комбинаций хромосомных плеч в двух транслоцированных хромосомах влияют на распределение точек инверсионных разрывов и в незатронутых транслокациями хромосомах.

Рис. а – комбинации хромосомных плеч, характерные для 2 основных цитокомплексов (т. е. групп видов с характерной комбинацией хромосомных плеч) рода Chiornomus: thummi – комбинация плеч

AB CD EF G, pseudothummi – AE CD BF G; б – локализация и частоты встречаемости точек инверсионных разрывов в плече А у видов рода Chironomus из цитокомплексов thummi (красные столбцы) и pseudothummi(синие столбцы). По оси абсцисс схематически представлена стандартная последовательность плеча А вида C. piger; в – цитофотокарта плеча А вида C. piger – эталонного вида рода Chironomus, относительно которого ведётся картирование последовательностей дисков всех остальных видов рода. Вертикальные линии, соединяющие рисунки б и в, показывают соответствие схематической последовательности дисков, приведённой на рис. б, реальным дискам на политенной хромосоме (рис. в).

Приоритетное направление РАН VI.45.; Программа СО РАН VI.45.1.3. Структурнофункциональная геномика эукариот: описторхиды и их хозяева (координатор д.б.н. В.А. Мордвинов).

В рамках проекта в ИЦиГ СО РАН сформирована уникальная коллекция, содержащая более 700 образцов различных видов гельминтов, вызывающих тяжелые заболевания человека и животных. Образцы собраны как на территории РФ, так и за рубежом (рис. 1, А). С использованием современных методов секвенирования проведено генотипирование значительной части образцов, представленных в коллекции (рис. Б, В). Результаты генотипирования имеют большое значение для развития исследований в области зоогеографии, молекулярной филогении, популяционной и эволюционной биологии возбудителей биогельминтозов, а также для разработки новых методов ДНК-диагностики эпидемиологически значимых паразитозов человека и животных. По данным ВОЗ, ежегодно каждый второй человек на планете заболевает гельминтозом. Широкая распространенность этих заболеваний обусловлена неэффективностью существующих методов выявления паразитов. Одним из решений проблемы является развитие ДНК-диагностики, основанной на результатах генотипирования образцов гельминтов из различных регионов мира.

Рис. Формирование коллекции образцов возбудителей биогельминтозов и разработка методов ДНК-диагностики этих заболеваний. А – желтыми звездами на карте обозначены точки сбора образцов гельминтов, представленных в коллекции. Разработка методов ДНК-диагностики биогельминтозов. Б – ПЦР-технология с последующим гель-электрофолрезом:Clonorchis sinensis (C. sin), Metorchis bilis (M. bil), Opisthorchis felineus (O. fel), Opisthorchis viverrini (O. viv); В – биочипы для идентификации видового состава биогельминтозов; Г – консенсусный митохондриальный геном двуусток, использованный в качестве основы для разработки маркеров при генотипировании возбудителей биогельминтозов.

Приоритетное направление РАН VI.45.; Программа СО РАН VI.45.1.4. Генетические и этолого-физиологические механизмы оптимизации воспроизводства и подходы к сохранению генофонда млекопитающих (координатор д.б.н. М.П. Мошкин).

Показано, что цитокин ФНО-? (фактор некроза опухолей) в семенной жидкости является индикатором репродуктивных «качеств» самцов мышей. Самки мышей руководствуются хемосигналами при выборе брачного партнера, способного дать обильное и здоровое потомство, что зависит, в том числе, и от качества семени. В опытах на мышах аутбредной линии ICR установлено, что среди различных характеристик спермы только содержание ФНО-? коррелирует и с запаховой привлекательностью. и с репродуктивным успехом самцов. Уровень ФНО-? был выше порога детектирования лишь у половины исследованных самцов (рис. А), но именно эти особи обладали более высокой привлекательностью для самок (рис. Б), а при покрытии такими самцами был отмечен более быстрый рост эмбрионов (рис. В). Оценка данного цитокина в семенной жидкости может найти применение при индустриальном разведении животных, а также при реализации программ по сохранению редких и исчезающих млекопитающих.

Рис. Индивидуальная изменчивость концентрации ФНО-? в семенной жидкости мышей (А) сопряжена с метаболическими процессами, формирующими сигналы запаховой привлекательности самцов (Б), и с процессами, которые определяют характеристики семени, значимо влияющие на эмбриональное развитие потомков (В).

Приоритетное направление РАН VI.45.; Программа СО РАН VI.45.1.4. Генетические и этолого-физиологические механизмы оптимизации воспроизводства и подходы к сохранению генофонда млекопитающих (координатор д.б.н. М.П. Мошкин, исп. д.б.н. О.В. Трапезов).

В ходе многолетней экспериментальной программы по выяснению универсальности эффектов дестабилизирующего отбора, открытого академиком Д.К. Беляевым, роли стресса и стрессируемости в эволюционных процессах на модельном объекте американской норке было показано увеличение темпов и размаха наследственной изменчивости, возникновение denovo фенотипических признаков, не зарегистрированных у этого вида в предшествующей эволюционной истории. В ходе многолетнего эксперимента была отработана технология создания новых оригинальных форм американской норки клеточного разведения. Государственная экспертная комиссия РФ по испытанию и охране селекционных достижений приняла решение о включении в Государственный реестр, новых оригинальных окрасочных форм американской норки, допущенных к использованию (Патент No 2010514, Патент No 3011).

Приоритетное направление РАН VI.45.; Программа СО РАН VI.45.1.5. Изучение механизмов интрогрессивной гибридизации и генетического контроля стрессоустойчивости растений с помощью методов хромосомной и генной инженерии (координатор д.б.н. Л.А. Першина).

Впервые исследован характер изменчивости митохондриальной (мт) ДНК при формировании интрогрессивных форм мягкой пшеницы в зависимости от происхождения цитоплазмы. С этой целью изучено состояние 18S/5S мт-повтора у созданных по разработанной схеме (рис.) пшенично-ячменных замещенных линий – 7H1Lmar(7D), с цитоплазмой ячменя H. marinum ssp. gussoneanum или пшеницы. Установлено, что состояние мт-повтора в виде гетероплазмии (одновременном присутствии мтДНК ячменного и пшеничного типа) или гомоплазмии по ячменному типу выявляется только у линий с цитоплазмой ячменя и ассоциировано с особенностями фертильности растений и присутствием хромосом ячменя. Вытеснение хромосом ячменя у этих линий приводит к переходу 18S/5S мт-повтора в состояние гомоплазмии пшеничного типа. Полученные данные указывают на значение направления скрещивания между ячменем и пшеницей, что определяет выявленный тип изменчивости мтДНК при интрогрессивной гибридизации.

Рис. Схема создания и изучения пшенично-ячменных замещенных линий пшеницы – 7H1Lmar(7D), имеющих цитоплазму пшеницы или ячменя H. marinum ssp. gussoneanum. В кариотипе пшеничноячменных замещенных линий зеленым цветом окрашены хромосомы ячменя. Обозначения ПЦРспектра: 1 – ячмень; 2 – пшеница; линии 7H1Lmar(7D) с цитоплазмой ячменя (3 – стерильные; 4 – частично фертильные; 5 – полностью фертильные); 6 – линии с цитоплазмой ячменя, но отсутствием хромосом ячменя; линии 7H1Lmar(7D) с цитоплазмой пшеницы (7 – частично фертильные; 8 – полностью фертильные). (HHH’H’ – геномная формула вида ячменя H. marinum ssp. gussoneanum; BBAADD – геномная формула мягкой пшеницы; 2n = 41 – число хромосом у моносомной линии мягкой пшеницы; 2n = 42 + 7HL – число хромосом у пшенично-ячменной дополненной линии.

Приоритетное направление РАН VI.45.; Программа СО РАН VI.45.1.6. Преобразования структуры и функции хромосом в эволюции, онтогенезе и клеточном цикле (координатор д.б.н. Н.Б. Рубцов).

Учеными Института цитологии и генетики СО РАН впервые проведен сравнительный анализ состава ДНК обогащенных повторами прицентромерных районов хромосом у близкородственных видов млекопитающих. В качестве модельной системы использованы лесные мыши рода Sylvaemus. Показано, что индивидуальные районы прицентромерного гетерохроматина содержат отличные друг от друга наборы повторенных последовательностей. Полученные данные согласуются с предложенной гипотезой о формировании репродуктивной изоляции путем накопления изменений в ДНК прицентромерных районов хромосом. Предложенный механизм позволяет решить проблему возникновения критических различий в геномах изолированных популяций в процессе видообразования (рис.).

Рис. Сравнение состава ДНК прицентромерных районов хромосом близких видов лесных мышей. (а) кластеры повторов, гомологичных ДНК прицентромерных районов хромосом 1 S.flavicollis (красный сигнал) и S. sylvaticus (зеленый сигнал) в хромосомах S. ponticus; (б) кластеры повторов, гомологичных ДНК прицентромерных районов хромосом 1 S. ponticus (красный сигнал) и S. sylvaticus (зеленый сигнал) в хромосомах S. flavicollis. Общая окраска хромосом – краситель DAPI (синий сигнал). Треугольниками обозначены половые хромосомы. Стрелки указывают на районы локализации кластеров соответствующих повторов.

Приоритетное направление РАН VI.45.; Программа СО РАН VI.45.1.7. Физическое картирование и секвенирование генома мягкой пшеницы. Cтруктурная организация и эволюция индивидуальных хромосом и генов (координатор д.б.н. Е.А. Салина).

Проведено молекулярно-генетическое картирование новых генов пшеницы, контролирующих пурпурную (антоциановую) окраску колоса, листа и стебля (рис.), что является отправной точкой для дальнейшего изучения молекулярно-генетических механизмов формирования данных признаков.

Сравнительное изучение ключевого гена биосинтеза антоцианов, кодирующего флаванон-3-гидроксилазу (F3h), в зависимости от генетического окружения и условий окружающей среды позволило установить, что экспрессия F3h в колеоптиле регулируется продуктом гена Rc и может изменяться под действием различных аллелей данного локуса, а также изменяется в ответ на солевой стресс и воздействие ионизирующим излучением.

Рис. а – колос пшеницы, окрашенный (слева) и неокрашенный (справа) антоцианами; б – молекулярно-генетические карты хромосом 2А и 7А пшеницы; Pg, Pls, Plb и Pc – новые локусы, контролирующие окраску колоса, листовых влагалищ, листовых пластинок и стебля соответственно.

Приоритетное направление РАН VI.45.; Программа СО РАН VI.45.1.7. Физическое картирование и секвенирование генома мягкой пшеницы. Cтруктурная организация и эволюция индивидуальных хромосом и генов (координатор д.б.н. Е.А. Салина, исп. к.б.н. Е.К. Хлесткина).

Молекулярно-генетическое картирование генов, контролирующих хозяйственно ценные признаки у гибридных форм пшеницы, позволило разработать новую схему проведения маркер-опосредованной селекции (заявка на патент No 2009125884, решение о выдачи патента от 29.07.2010). Использование этой схемы позволило в короткие сроки создать новые доноры устойчивости мягкой пшеницы к бурой ржавчине. Тестирование полученных линийдоноров проводили методами микросателлитного генотипирования и гибридизацией in situ (рис.). Показано, что линии пшеницы, содержащие локус QLr.icg-5G от Triticum timopheevii, являются полностью устойчивыми к бурой ржавчине и не отличаются по показателям продуктивности от исходного сорта. Полученные линии могут быть рекомендованы для включения их в качестве доноров устойчивости к бурой ржавчине в селекционные программы по мягкой пшенице.

Рис. А – молекулярно-генетическая карта хромосомы 5В изогенных линий мягкой пшеницы. Транслокация от T. timopheeviiвыделена красным цветом. QLr.icg-5G – локус, контролирующий устойчивость к бурой ржавчине. Справа указаны номера микросателлитных маркеров (Xgwm.); Б – идентификация транслокации методом гибридизация in situ. Красный сигнал гибридизации маркера Spelt1, указывает на присутствие транслокации от T. timopheevii. Идентификация хромосом выполнена по распределению маркера pSc119.2 (зеленый сигнал).

Приоритетное направление РАН VI.45.; Программа СО РАН VI.45.1.8. Механизмы формирования генетического разнообразия растений, создание коллекций уникальных генофондов, доместикация, эволюция растений (координатор акад. В.К. Шумный, исп. чл.-корр. РАСХН Н.П. Гончаров).

Гены Vrn (от анг. response to vernalization) детерминируют одно-двулетний тип развития (яровость-озимость) и скорость протекания многих процессов роста и развития растения пшеницы, влияют на выраженность многих хозяйственно-важных признаков и скороспелость. Сравнительно-генетическими и молекулярно-биологическими методами изучен характер мутаций в регуляторных районах генов, вовлеченных в процесс доместикации и селекции, и частота распространения такого рода мутаций среди видов пшениц разного уровня плоидности. Описаны новые аллели генов VRN1, позволяющие сделать заключение о независимом происхождении яровости (однолетности) у доместицированных пшениц от их диких предков. Полученная информация будет способствовать реконструкции процесса доместикации у злаков, анализу эволюционных взаимоотношений видов пшениц и может быть использована при селекции яровых сортов культуры на скороспелость-позднеспелость.

Рис. Вариабильность VRN1 промоторов A генома у пшениц различного уровня плоидности, их происхождение и наследование.

Прямоугольниками указаны делеции (маленький прямоугольник равен 8 п.о.), треугольниками – вставки транспозонов. T_m - T. monococcum, T_u - T. urartu , T_b – T. boeoticum, T_tu – T. turgidum, T_di – T. dicoccum, T_du – T. durum, T_t – T. turanicum, T_ti – T. timopheevii, T_ar – T. araraticum; Sar – замещенная линия Саратовская/Вьетнамская 5R(5A), Pir – сорт Пиротрикс 28, Mir – сорт Мироновская яровая, Jup – сорт Jupateko.

Приоритетное направление РАН. 6.47.; Программа СО РАН VI.47.1. Молекулярная генетика. Механизмы реализации генетической информации. Биоинженерия. Программа VI.47.1. Механизмы контроля молекулярно-генетических систем и процессов. Нанобиоинженерия. 1. Механизмы транскрипционной регуляции экспрессии генов и соматического мутагенеза (координатор Т.И. Меркулова).

На модели инбредных мышей, чувствительных (C3H) и устойчивых (C57BL и CC57BR) к действию фенобарбитала как промотора опухолей печени, показана ключевая роль конститутивного рецептора андростанов (CAR) в механизме действия этого соединения. Установлено, что только в печени мышей С3Н фенобарбитал активирует СAR (рис. А, Б) и усиливает экспрессию его генов–мишеней: SULT2A1 (рис. В), основного фермента катаболизма тиреоидных гормонов, и MDM2 (рис. Г), важного регулятора пролиферации и апоптоза. Таким образом, CAR-опосредованная стимуляция гепатоканцерогенеза фенобарбиталом может осуществляться за счет одновременного подавления опухолесупрессорной функции тиреодных гормонов и индукции генов, непосредственно контролирующих пролиферацию и апоптоз.

Рис. Фенобарбитал (ФБ) увеличивает ДНК-связывающую активность CAR и уровень мРНК Sult2A1 и Mdm2 в печени мышей С3Н, но не CC57BR и C57BL. А – типичный радиоавтограф изменения ДНК-связывающей активности CAR; Б – результаты количественной обработки радиоавтографов. За единицу принята активность CAR в печени животных, не получавших ФБ. В скобках – количество экспериментов; В, Г – данные RT-QPCR по уровню экспрессии генов Sult2A1(В) и Mdm2(Г) представлены в относительных единицах от уровня экспрессииGapdh. Достоверные отличия от животных, не получавших ФБ. * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,005.

Приоритетное направление РАН. 6.47.; Программа СО РАН VI.47.1. Молекулярная генетика. Механизмы реализации генетической информации. Биоинженерия. Программа VI.47.1. Механизмы контроля молекулярно-генетических систем и процессов. Нанобиоинженерия. 2. Нанобиоинженерия, протеомика: новые методы исследования биообъектов (координатор к.б.н. С.Е. Пельтек).

Показано, что терагерцовое излучение (ТГцИ) может изменять уровень экспрессии генов. Эксперименты проведены с использованием клеток E. coli, несущих специально разработанную генноинженерную конструкцию (геносенсор E. coli/pDps-gfp) для тестирования присутствия перекиси водорода. Облучение ТГцИ клеток с геносенсором E. coli/pDps-gfp приводило к такому же изменению уровня экспрессии репортерного белка GFP, как и воздействие перекисью водорода. Методами протеомного анализа показано, что при облученииТГцИ происходило изменением экспрессии еще ряда генов. Изменение экспрессии было выявлено проведением двумерного электрофореза белков контрольных клеток и клеток, подвергнутых облучению (рис. а, б). Идентификация соответствующих белков проведена масс-спектрометрией (рис. в). Биоинформационный анализ промоторных районов генов, кодирующих эти белки, показал наличие в них сайтов связывания транскрипционных факторов OxyR и MarA.

Рис. Изменение уровня экспрессии генов E. coli в ответ на облучение ТГцИ. а – образцы высоковоспроизводимого двумерного электрофореза белков E. coli1 (разделение белков проводили в двух направлениях – по оси Х согласно их изоэлектрическим точкам (pI, ось Х) и молекулярным массам (Мw, ось Y); б – увеличенные фрагменты двумерного электрофореза. Стрелками отмечены фракции белков, изменивших свою экспрессию в результате воздействия терагерцового излучения; с – идентификация белков проведена методом MALDI-TOF масс-спектрометрии с последующим биоинформатическим анализом.

Приоритетное направление VI.49. Клеточная биология. Теоретические основы клеточных технологий.

Программа VI.49.1. Клеточные и молекулярные механизмы, регулирующие онтогенез и морфогенез. Технологии управления дифференцировкой и пролиферацией клеток. Программа СО РАН VI.49.1.1. Транскрипционные факторы, организация хромосом и интерфазного ядра и цитоплазмы при дифференцировке и перепрограммировании геномов дифференцированных клеток (координатор д.б.н. О.Л. Серов, исп. д.б.н. С.М. Закиян).

Исследователями ИЦиГ СО РАН выявлены особенности механизма инактивации Х-хромосомы сумчатых, отличные от механизма инактивации Х-хромосомы плацентарных млекопитающих. Сравнением присутствия в хромосомах маркеров активного и неактивного хроматина методом иммунофлуоресцентной окраски метафазных хромосом у сумчатого опоссума M. domestica показано, что распределение модификаций гистонов, являющихся маркерами неактивного хроматина, на Х-хромосомах отличается от описанного для плацентарных млекопитающих. Впервые установлено, что у сумчатых, эволюционно древних млекопитающих, в отличие от плацентарных, неактивная Х-хромосома обогащена гистоном H3, триметилированным по лизину K9 (H3K9me3, маркер активного хроматина). Эухроматиновые районы активной Х-хромосомы, как и у плацентарных, обогащены гистоном H3, диметилированным по лизину K4 (H3K4me2). Сформулирована гипотеза, что у сумчатых H3K9me3 выполняет основную функцию в процессе поддержания инактивации Х-хромосомы (рис.).

Рис. Иммунофлуоресцентное окрашивание метафазных хромосом самки (а) и самца (б) M. domestica антителами к гистону Н3, диметилированному по лизину K4 (H3K4me2), и к гистону Н3, триметилированному по лизину K9 (H3K9me3). Стрелками указаны активная (Ха) и неактивная (Xi) Х-хромосомы. Общая окраска хромосом красителем DAPI – синий сигнал, H3K4me2 – зеленый, H3K9me3 – красный. Ха, Хi – активная и неактивная Х-хромосомы соответственно; в – сверху вниз: увеличенное изображение активной и неактивной Х-хромосом самки, активной Х-хромосомы самца.

Приоритетное направление VI.50. Биофизика. Радиобиология. Математические модели в биологии. Биоинформатика.

Программа СО РАН VI.50.1. Компьютерно-экспериментальный анализ и моделирование молекулярно-генетических, биофизических, экосистемных и биосферных процессов. Программа СО РАН VI.50.1. 2. Биоинформатика и системная биология молекулярногенетических систем и процессов (координатор акад. Н.А. Колчанов).

Исследованы молекулярно-генетические механизмы эволюционной адаптации микроорганизмов к экстремально высоким давлениям. Для трех видов архей, проживающих на разных глубинах мирового океана, была реконструирована их дивергенция от общего предка (рис. а). Впервые показано, что адаптивная эволюция при изменении давления в зоне проживания сильно затрагивает системы трансляции и непосредственно структуры рибосом. Анализ РНК-связывающего белка Nip7 методами молекулярной динамики показал, что адаптация приводит к структурным изменениям отдельных участков Nip7 (рис. б). Показано, что с помощью данных методов можно проводить in silico дизайн микроорганизмов, устойчивых к экстремальным условиям среды.

Рис. Филогенетические взаимоотношения между рассматриваемыми представителями архей рода Pyrococcus (P. furiosus, P. horikoshii и P. abyssi) (а) и анализ молекулярной динамики белка Nip7 археи P. furiosus (б). Для архей рода Pyrococcus указаны глубины мест обитания и давления (а). Приведена модель третичной структуры белка Nip7: желтым цветом выделен участок, подвергавшийся наибольшим флуктуациям при давлении 100 МПа (1000 атм), красным – ?-спирали, синим – ?-листы, зеленым – повороты, серым – неструктурированные элементы (б).

Приоритетное направление VI.51. Биотехнология.

Программа VI.51.1. Микробиология и вирусология, искусственные генетические системы, биотехнологии создания терапевтических препаратов и новых материалов (координатор акад. В.В. Власов).

Программа СО РАН VI.50.1.5. Генетически модифицированные растения и животные как продуценты фармакологически ценных белков (координатор д.б.н. Е.В. Дейнеко).

Разрабатывается перспективная технология получения рекомбинантных фармакологически ценных белков в растительных системах на основе клеточных суспензионных культур. В результате оценки различных сортов и форм двудольных растений с использованием фитогормонов и трофических факторов отобраны две клеточные линии, характеризующиеся высокой скоростью накопления биомассы клеток (рис. а). Выявлено, что суспензионная культура клеток амаранта является наиболее перспективной по скорости накопления биомассы. Создана генетическая конструкция (рис. б) с геном зеленого флюоресцирующего белка (GFP), позволяющая количественно оценивать уровень накопления рекомбинантного белка (рис. в). Оптимизированы условия проведения агробактериальной трансформации клеточных культур амаранта, моркови и табака.

Рис. Некоторые технологические аспекты получения рекомбинантных белков в растительных системах на основе клеточных суспензионных культур.

Приоритетное направление VI.52. Физиология нервной и висцеральных систем. Клиническая физиология.

Программа VI.52.1. Генетико-физиологические механизмы гормональной регуляции висцеральных функций и поведения. Доместикация как модель эволюции.

Координатор – академик Л.Н. Иванова.

Программа VI.52.1.1. Функциональная нейрогеномика: анализ полиморфизма и экспрессии генов, обеспечивающих функции мозга и поведение (координатор д.б.н.Н.Н. Дыгало).

Впервые обнаружено, что экспрессия антиапоптозного белка Bcl-xl в гиппокампе коррелирует с психоэмоциональной устойчивостью к стрессу. Экспрессия Bcl-xl существенно более выражено повышается при стрессе (рис.) у устойчивых, чем у чувствительных животных, впадающих при действии стресса в депрессивно-подобное состояние. Этот результат указывает на новый ген, участвующий в проявлении индивидуальных различий по предрасположенности к развитию психопатологии под воздействием стресса. Разработка способов повышения экспрессии этого гена при стрессе может привести к созданию антидепрессантов нового типа.

Рис. Повышенная экспрессия антиапоптозного белка Bcl-xl в гиппокампе придает устойчивость к развитию депрессии в условиях стресса.

А – микрофотография среза гиппокампа чувствительных к стрессу животных; В – увеличенное изображение выделенного квадратом на микрофотографии А участка зубчатой извилины; С – микрофотография среза гиппокампа устойчивых к стрессу крыс; D – увеличенное изображение выделенного квадрата микрофотографии C.

Зернистое окрашивание – Bcl-xl-иммунопозитивные клетки в гиппокампе.

Приоритетное направление VI.52. Физиология нервной и висцеральных систем. Клиническая физиология.

Программа VI.52.1. Генетико-физиологические механизмы гормональной регуляции висцеральных функций и поведения. Доместикация как модель эволюции.

Программа VI.52.1.2. Физиологическая генетика эндокринной регуляции функций, поведения и доместикации (координатор акад. Л.Н. Иванова).

Открыт один из важных механизмов снижения агрессивности за счет увеличения экспрессии глюкокортикоидных рецепторов в отделах мозга и усиления механизма отрицательной обратной связи в системе регуляции стрессовых реакций. Путем селекции диких серых крыс по поведению получена линия «ручных» крыс, лишенных агрессивности по отношению к человеку. Сравнительный анализ уровня мРНК рецептора глюкокортикоидов (ГР) выявил наличие более высокого уровня экспрессии гена ГР в гиппокампе «ручных» серых крыс, отобранных на отсутствие агрессивно-оборонительной реакции по отношению к человеку. Подавление агрессивности у диких серых крыс, селекционированных на «ручное» поведение, связано со значительным увеличением числа глюкокортикоидных рецепторов в гиппокампе, что является причиной усиления отрицательной обратной связи со стороны гормонов коры надпочечника и подавления как стрессовых реакций, так и агрессивного поведения.

Рис. Система обратных связей, задействованных в подавлении агрессивности у диких серых крыс. а – обозначены структуры головного мозга – гиппокамп, гипоталамус, гипофиз – участвующие в центральной регуляции стрессовых реакций. Красными стрелками показаны прямые стимулирующие связи, благодаря которым надпочечник секретирует гормоны стресса – глюкокортикоиды. Глюкокортикоиды ингибируют центральный стимулирующий аппарат вследствие наличия отрицательной обратной связи (синие стрелки); б – результат селекции по поведению: дикие серые крысы становятся ручными.

Приоритетное направление VI.53. Эволюционная, экологическая физиология, системы жизнеобеспечения и защиты человека.

Программа VI.53.1. Создание моделей патологических состояний человека: исследование генетико-физиологических, молекулярно-генетических и биофизических механизмов. Программа VI.53.1. 1. Исследование и экспериментальное моделирование болезней человека: молекулярно-генетические, морфофизиологические и биофизические механизмы (координатор д.б.н. А.Л. Маркель).

Исследования генетической предрасположенности к развитию болезни Альцгеймера проведены методом полногеномного анализа сцепления генетических локусов с белками – маркерами болезни Альцгеймера. Показано, что в мозге концентрация белка ?-амилоида (АВ40), одного из белков-маркеров, контролируется двумя генетическими локусами. Один из них расположен в хромосоме 1, другой – в хромосоме 11. Мутации в районе первого локуса ассоциированы с развитием болезни Альцгеймера в раннем возрасте. Второй локус находится в районе, ассоциированном с депрессией, аутизмом и поздними формами болезни Альцгей-мера. На рисунке представлены данные по сцеплению изменения концентрации белка ?-амилоида (АВ40) в плазме крови с геномными локусами, расположенными на 1-й и 11-й хромосомах человека.

(Приоритетное направление РАН VI.53.; Программа СО РАН VI.53.1.1.; ИЦиГ СО РАН, д.б.н. А.Л. Маркель).

Рис. Показатель вероятности сцепления (Lod score) концентрации белка ?-амилоида (АВ40) в плазме крови с геномными локусами, расположенными на 1-й и 11-й хромосомах человека. Расстояния на генетической карте (ось Х) представлены в сМ. Ниже приведены идиограммы хромосом 11 и 1 в направлении (pter > qter).

Результаты научно-исследовательских работ по программам президиума ран

Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН А.II.5

Фундаментальные науки – медицине (координатор акад. А.И. Григорьев)

Проект 5.1. Применение нейротрофического фактора мозга (BDNF) для коррекции наследственных нарушений функции мозга и поведения (д.м.н. Н.К. Попова).

Впервые показано, что серотониновые 5-НТ3 рецепторы мозга участвуют в механизмах терморегуляции, вызывая выраженную и продолжительную гипотермию (рис.). Выявлено вовлечение серотониновых рецепторов 5-НТ2А типа в регуляцию генетической предрасположенности к каталепсии, являющейся синдромом шизофрении и депрессии у людей. Установлено, что у генетически предрасположенных к каталепсии мышей снижена экспрессия гена и понижена чувствительность 5-НТ2А рецептора.

Рис. 1. Динамика изменения температуры тела, вызванного центральным введением селективного агониста 5-НТ3 рецептора (m-CPBG).

Проект 5.4. Условия раннего онтогенеза и формирование гипертензивного статуса при наследственной артериальной гипертонии: фундаментальные и прикладные аспекты (акад. Л.Н. Иванова).

Экспрессия гена COMT (катехол-О-метил трансферазы), который кодирует основной фермент катаболизма катехоламинов в почке, понижена у гипертензивных крыс НИСАГ. В корковом веществе почки экспрессия COMT понижена в покое, а в мозговом веществе почки – и в покое, и при стрессе. Повышение активности симпатической нервной системы в мозговом веществе почки у крыс НИСАГ, очевидно, стимулирует реабсорбцию натрия в дистальных отделах почечных канальцев, что приводит к включению почечного звена в патогенез стресс-зависимой артериальной гипертонии (рис.). Показано наличие достоверного увеличения экспрессии альфа-1А-адренорецепторов в отделах мозга, миокарде и ткани почки у крыс линии НИСАГ (ISIAH) со стресс-зависимой артериальной гипертонией. Это свидетельствует о существенном вкладе симпатической нервной активности в патогенез стресс-зависимой артериальной гипертонии.

Экспрессия альфа1-А адренорецепторов (мРНК) в тканях органов крыс WAG и ISIAH (НИСАГ)

Рис. Экспрессия альфа-1А адренорецепторов (мРНК) в тканях органов крыс WAG и ISIAN (НИСАГ).

Проект 5.8. Создание новых антинейродегенеративных средств, воздействующих на экспрессию белков апоптоза в мозге (д.б.н. Н.Н. Дыгало).

Разработана тест-система определения апоптогенной активности препаратов in vivo (Патент RU No 2388065 C1 от 27.04. 2010). Установлена перспективность композиций адъювантов (глицирризиновой кислоты) с лигандами адренергических рецепторов. При совместном введении клонидина, действующего на рецепторы клеточной мембраны, с глицирризиновой кислотой, угнетающей разрушение кортикостероидов и в результате повышения уровня эндогенного гормона стимулирующей его внутриклеточные рецепторы, наблюдалось взаимное купирование негативных побочных эффектов каждого из этих препаратов (рис.) на экспрессию мозгового нейротрофического фактора (BDNF). Результаты свидетельствуют о возможности целенаправленного управления экспрессией клинически важных генов адекватной комбинацией фармакологических средств, комплексно воздействующих на разные системы сигнальной трансдукции в клетке.

Рис. Совместное воздействие на ядерные и мембранные рецепторы клетки качественно меняет их эффекты на экспрессию нейротрофического фактора BDNF в мозге.

Уровень мРНК BDNF в гиппокампе 7-дневных крысят после введения им на 3-й день жизни: 1 – физиологического раствора; 2 – глицирризиновой кислоты; 3 – клонидина; 4 –глицирризиновой кислоты совместно с клонидином. Стрелки указывают направление достоверных эффектов при раздельном и совместном применении препаратов.

Проект 5.13. Молекулярные механизмы развития хориоретинальной дегенерации у крыс OXYS – первой отечественной модели возрастной макулодистрофии для исследования ее патогенеза, разработки способов лечения и профилактики (д.б.н. Н.Г. Колосова).

Получены новые данные, свидетельствующие о перспективности использования крыс OXYS в качестве модели возрастной макулярной дегенерации (ВМД). Офтальмоскопические наблюдения подтверждены данными электроретинографии – методом количественной оценки функционального состояния нервных клеток сетчатки, основанным на регистрации биопотенциалов, возникающих в ней при световом раздражении. Показано, что до возраста 14 мес. у крыс OXYS хориоретинальная дегенерация (или ретинопатия) соответствует атрофической форме ВМД у людей. В дальнейшем ретинопатия прогрессирует и у 8–10 % животных старших возрастных групп выявляются признаки влажной ВМД. Развитие ретинопатии у крыс OXYS связанно со структурно-функциональной недостаточностью клеток ретинального пигментного эпителия, изменением в нем экспрессии генов ключевых регуляторов ангиогенеза: фактора роста эндотелия сосудов VEGF и фактора пигментного эпителия PEDF, нарушением хориоретинального кровотока, которые и приводят к гибели фоторецепторов.

Рис. Изменения с возрастом экспрессии генов VEGF (А) и PEDF (Б) в сетчатке крыс Вистар и OXYS. Нормализация по RPL30. * достоверные межлинейные различия; ^ – достоверные изменения по сравнению с животными той же линии более молодого возраста.

Проект 5.21. Сравнительный анализ состава ДНК С-позитивных районов хромосом человека и медико-генетическое консультирование (д.б.н. Н.Б. Рубцов).

Разработана новая модификация метода получения ДНК-проб для проведения флуоресцентной гибридизации in situ, использующая LA-ПЦР для сиквенс-независимой амплификации ДНК. Полученные ДНК-пробы дают сигнал преимущественно в С-негативных районах хромосом. В С-позитивных районах хромосом флуоресцентный сигнал практически отсутствует. При помощи ПЦР выявлено, что в составе полученных ДНК-зондов представлены фрагменты уникальных последовательностей. Разработанный метод открывает возможности проведения FISH без супрессии повторенных последовательностей ДНК.

Рис. Результат совместной гибридизации ДНК-пробы, полученной разработанным методом (красный сигнал) и ДНК-пробы, полученной из геномной ДНК человека nick-трансляцией (зеленый сигнал), с метафазными хромосомами здорового донора (а); профили интенсивностей сигналов на хромосоме 1, 16 и 19 человека (б); Окраска хромосом красителем DAPI (синий сигнал). – указывают на интенсивный FISH сигнал на хромосоме 19; головки стрелок указывают на половые хромосомы XY.

Проект 5.26. Информационно-компьютерные подходы к поиску оптимальных фармакологических стратегий коррекции патологических состояний организма (акад. Н.А. Колчанов).

С использованием математической модели репликации репликона вируса гепатита С (ВГС) исследованы эффекты действия новых потенциальных лекарств – ингибиторов важнейших ВГС мишеней (NS3 протеазы, NS5B полимеразы, 5’UTR области генома) на репликацию ВГС репликона в Huh-7 клетках. Показано, что эффективность действия ингибиторов падает в ряду мишеней: NS5B полимераза, 5’UTR, NS3 протеаза. Таким образом, из модели предсказано, что оптимальной мишенью действия потенциальных лекарств является NS5B полимераза (рис., синяя стрелка 2).

Рис. Схема процессов репликации ВГС репликона в Huh-7 клетке в присутствии ингибиторов разных типов. Синими стрелками показаны определенные по модели три наилучшие мишени действия потенциальные лекарств: 1 – процессинг полипротеина (ингибиторы NS3 протеазы), 2 – инициация репликации (ингибиторы NS5B полимеразы), 3 – инициация трансляции (антисенс-олигомеры к 5’UTR).

Проект 5.28. Хроническая тревога и иммунодефицит: поиски рациональной фармакотерапии (Инновационное исследование) (д.б.н. Н.Н. Кудрявцева).

Показано, что хронический социальный стресс, вызванный негативным опытом агонистических (конкурентных) взаимодействий приводит к развитию выраженного уровня тревожности у самцов мышей и нарушению у них социального поведения (избегание партнера и снижение коммуникативности (рис.). Хроническое введение анксиолитика диазепама, вводимого стрессированным животным в течение двух недель, существенно снизило состояние тревоги и восстановило коммуникативность.

Рис. Поведение самцов мышей (контроль, а также стрессированные самцы после хронического введения физиологического раствора и диазепама) в тесте «социальные взаимодействия» (А) и в тесте на коммуникативность (В). Представлены данные, свидетельствующие о высоком уровне тревожности у стрессированных самцов: обнаружено увеличение времени избегания партнера на нейтральной территории (А) и снижение реакции на нового партнера в условиях домашней клетки (В) (время пребывания возле разделительной преграды, за которой находится незнакомый партнер). Диазепам купировал состояние тревоги, что привело к нормализации социального поведения. * p < 0,5, *** p < 0,001 – по сравнению с контролем; ## p < 0,01; ### p < 0,001 – по сравнению со стрессированными самцами, получавшими физиологический раствор.

Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН А.II.6 Молекулярная и клеточная биология (координатор акад. Г.П. Георгиев)

Проект 6.8. Системная биология: компьютерно-экспериментальные подходы (акад. Н.А. Колчанов).

Транскрипция у эукариот начинается с посадки ТАТА-связывающего белка (ТВР) на коровый промотор гена при наличии TATA-бокса (ТАТА+) или без него, неспецифически, благодаря содействию других белков (ТАТА-). Мы обнаружили эффект изменения статуса ТАТА+/ТАТА- в эволюции транскрипционных факторов ARF (Auxin Response Factors), которые опосредуют первичный ответ на ауксин и задействованы в различных морфогенетических процессах. Оценив сродство ТВР/ДНК в промоторах ARF генов арабидопсиса (AtARF) и риса (OsARF), мы классифицировали их как ТАТА+ и как ТАТА-. Наши прогнозы по связыванию ТВР c коровым промотором ТАТА+ AtARF и OsARF генов коррелировали с уровнем их экспрессии в микроаррэй экспериментах (рис.). Установлено, что ТАТА+/ТАТА- статус AtARF гена у арабидопсиса взаимосвязан с функцией его белка как репрессора или активатора транскрипции. У риса, напротив, OsARF репрессоры чаще имеют ТАТА - статус (? < 0,005).

Рис. Изменения статуса ТАТА+/ТАТА- в эволюции транскрипционных факторов ARF, определяющих первичный ответ на гормон ауксин. А. Оценка сродства TBP/ДНК на примере промоторов AtARF1 и AtARF7 генов. Пунктир – верхняя доверительная 5 %-граница неспецифического сродства ТВР/ДНК для семейства генов AtARF. Б. Изменение ТАТА+/ТАТА- статуса в эволюции суперсемейства генов AtARF A. thaliana и OsARF O. sativa, полученная при анализе филогенетического древа, восстановленного на основе принципа максимальной парсимонии по кодирующим частям ARF генов. В. Сродство ТВР к потенциальным ТАТА-боксам генов AtARF достоверно коррелирует (t = 0,615, ? < 0,05) с изменением экспрессии генов в ответ на ауксин. Г. Сродство ТВР к потенциальным ТАТА- боксам генов OsARF достоверно коррелирует с наименьшим уровнем конститутивной экспрессии (t = 0,500, ? < 0,05), измеренной в разных тканях методом микроаррэй.

Проект 6.9. Молекулярная биология серотониновой системы мозга в экспериментальных моделях генетической предрасположенности к агрессии и депрессии (д.м.н. Н.К. Попова).

В результате изучения биологии серотониновой системы мозга в экспериментальных моделях генетической предрасположенности к агрессии и депрессии было выявлено, что фармакологическая активация 5-НТ2А рецепторов приводит к существенному снижению интенсивности каталепсии (рис.).

Рис. Влияние агониста 5-НТ2А рецепторов (DOI) на выраженность наследственной каталепсии.

Проект 6.11. Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов эукариот в ходе онтогенеза (д.б.н. С.М. Закиян).

Получены индуцированные плюрипотентные клетки человека – новый тип плюрипотентных клеток, которые могут быть получены из соматических клеток путем свехэкспрессии набора определенных генов. Репрограммирование фетальных нейральных стволовых клеток и фибробластов кожи эмбриона человека проведено путем трансдукции адено- и ретровирусными векторами, несущими кДНК генов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc мыши. В результате были получены клетки, обладающие свойственными эмбриональным стволовым клеткам человека экспрессией белков и паттерном транскрипции генов (рис.). Нами показано, что полученные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки способны дифференцироваться in vitro в производные эктодемы, мезодермы и энтодермы. Кроме того, мы установили, что ИПСК человека, полученные из фетальных нейральных стволовых клеток, могут успешно подвергаться направленнoй хондрогенной дифференцировке in vitro, с последующей самосборкой функциональной хрящевой ткани, содержащей необходимые компоненты внеклеточного матрикса.

Рис. А – морфология колоний ИПСК, полученных из эмбриональных фибробластов человека; Б – окраска колоний ИПСК на экспрессию щелочной фосфатазы (одного из маркеров плюрипотентных клеток).

Проект 6.12. Изучение структурно-функциональной организации и механизмов сборки ядерной оболочки (к.б.н. Е.В. Киселева).

Впервые изучена 3-мерная организация ядерных поровых комплексов растений и продемонстрирован универсальный принцип строения нано-компонентов ядерных пор низших и высших эукариот. Продемонстрированы этапы сборки ядерных пор растений и их динамика на разных стадиях клеточного цикла (рис.). Показано, что в геноме растений отсутствуют гены гомологичные тем, что кодируют белки ламины у животных. Используя модифицирован ные нами методы выделения ядер из клеток корешков лука и клеток культуры табака, а также высокоразрешающую сканирующую электронную микроскопию мы (совместно с учеными из Университета в г. Дурхам, Англия) впервые получили 3-мерные снимки ядерных пор высших растений, подтверждающие эволюционную консервативность организации этих органелл у всех эукариот.

Проект 6.15. Молекулярно-генетические механизмы комплексных поведенческих, морфологических и физиологических признаков: экспериментальное исследование на селекционных моделях животных (д.б.н. А.Л. Маркель).

При изучении молекулярно-генетических механизмов доместикационного поведения лисиц был выявлен достоверный эффект гаплотипа No 242, маркированного микросателлитом REN01-G01 (12-я хромосома). Установлено, что влияние этого гаплотипа на поведение в значительной степени зависит от геномного контекста, что было показано при анализе различных генетически расщепляющихся субпопуляций лисиц. Идентифицированы локусы, ответственные за показатель «степень прирученности» (рис. 1, 2).

Рис. 1. Пример радикального изменения поведения лисиц, подвергнутых целенаправленной селекции на доместикационное поведение.

Рис. 2. Генетические локусы, ассоциированные с поведенческой первой главной компонентой, обозначенной как «степень прирученности».

Проект 6.16. От поведения к гену: Молекулярные механизмы агонистического поведения (д.б.н. Н.Н. Кудрявцева).

Повторный опыт агрессии у мышей сопровождается увеличением экспрессии генов Th, Dat1 и Snca в вентральной тегментальной области мозга, причем экспрессия Th и Dat1 сохраняется повышенной в течение 2 недель после прекращения агонистический взаимодействий (рис.). Делается вывод, что экспрессия исследованных генов меняется по-разному в разных областях мозга в зависимости от функциональной активности моноаминергических систем, различающейся у животных разных социальных групп.

Pис. Относительный уровень мРНК генов Th и Dat1 в вентральной тегментальной области агрессивных самцов мышей до (темно-синие столбы) и после (светло-синие столбы) 2-недельной депривации. Р < 0,05.

Проект 6.17. Скрытый кодирующий потенциал эукариотических мРНК: выявление альтернативных сигналов инициации трансляции и новых форм эукариотических белков и биологически-активных пептидов (к.б.н. А.В. Кочетов).

Исследована зависимость одного из важных физико-химических параметров нуклеотидной последовательности РНК – «размер доступной для взаимодействия поверхности» (accessible surface area, ASA) – от нуклеотидного контекста. В рамках проекта нами было впервые показано, что среднее значение параметра ASA для нуклеотида в молекуле РНК контекстно-зависимо, т. е. в значительной степени определяется типом соседних нуклеотидов (рис.). К числу интересных результатов относится тот факт, что триплет AUG – наиболее часто используемый стартовый кодон трансляции – характеризуется одним из наиболее высоких значений ASA.

Рис. Среднее значение ASA для триплетов в составе молекул РНК.

Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН Б.26 Биологическое разнообразие (координатор акад. Д.С. Павлов)

Проект 26.21. Изучение полиморфизма генов, детерминирующих количественные признаки человека (д.б.н. Т.И. Аксенович).

Известно, что результаты картирования генов, контролирующих различные признаки человека, в большой степени зависят от точности генетической карты. В связи с этим, имеет смысл уточнять генетическую карту, используя данные о структуре и генотипах анализируемой выборки. Мы построили генетическую карту для молодой изолированной популяции г. Рукфен, Нидерланды (карта ERF) и сравнили ее с картой, построенной для используемой панели маркеров Illumina. В целом, генетические длины находятся в хорошем соответствии с физическими размерами хромосом (r = 0,95 для Illumina и r = 0,94для ERF) и между собой (r = 0,99). Были отмечены расхождения между генетической картой Illumina и ERF, большая часть из которых наблюдалась в концевых участках хромосом. Можно предположить, что локальные расхожения отражают популяционные особенности выборки. В этом случае использование построенной нами карты для анализа сцепления на выборке ERF будет более корректным, чем использование карты Illumina.

Рис. Распределения плотности рекомбинации для аутосом человека согласно генетической карте Illumina (черная линия) и карте ERF, полученной в данном исследовании (красная линия). Ось Х указывает физическое расстояние в мегабазах (Мб), позиция центромеры отмечена буквой С. По оси Y отложена частота рекомбинации (сМ/Мб). Частота рекомбинации была рассчитана как среднее значение для маркеров в окне размером 3 Мб со сдвигом в 1 Мб.

Проект 26.22. Исследование молекулярно-генетических механизмов стрессоустойчивости на модели трансгенных растений. Оптимизация экспрессии трансгенов (к.б.н. А.В. Кочетов).

Цель работы заключалась в изучении механизмов устойчивости растений к патогенам и абиотическим стрессам на модели трансгенных растений. Созданы новые генетические модели – линии трансгенных растений табака и картофеля с измененным паттерном экспрессии генов, потенциально задействованных в генных сетях стрессового ответа: экстраклеточных рибонуклеаз и орнитинаминотрансферазы. Впервые показано, что увеличенный уровень экспрессии орнитинаминотрансферазы сопровождается повышением устойчивости к абиотическим стрессам и этот механизм не связан с синтезом пролина. Обнаружено, что экспрессия гена орнитинаминотрансферазы в нормальных условиях связана с придаточными почками, что позволило выдвинуть предположение об активном участии этих органов в метаболизме азота (конверсии орнитина в глутамат). Также впервые показано, что изменение в содержании экстраклеточных рибонуклеаз не сопровождается заметными морфологическими и физиологическими изменениями у трансгенных растений.

Рис. Визуализация экспрессии репортерного гена бета-глюкуронидазы, экспрессирующегося в трансгенных растениях Nicotiana tabacum под контролем промотора гена орнитинаминотрансферазы (в нормальных условиях): а – растение в возрасте 4 недель; б – срез придаточной почки.

Проект 26.23. Генетическое разнообразие и популяционная динамика добавочных В-хромосом млекопитающих (д.б.н. Н.Б. Рубцов).

Получены микродиссекционные ДНК-пробы из В-хромосом мышей отловленных из удаленных друг от друга популяций (от Западной Сибири до Приморского края). Проведены эксперименты по кроссгибридизации in situ полученных ДНК-проб с метафазными хромосо мами животных из других популяций. Проведено секвенирование последовательностей ДНК, формирующих В-хромосомы. Показано, что дополнительные элементы A. peninsulae преимущественно состоят из повторенных последовательностей гомологичных прицентромерным районам хромосом. Проведен контекстный анализ результатов секвенирования и определена локализация клонированных последовательностей. Показана кластерная организация повторенных клонированных последовательностей в А- и В-хромосомах (рис.).

Рис. FISH клонированного фрагмента ДНК из В-хромосомы восточноазиатской мыши с ее метафазными хромосомами. Стрелками указаны В-хромосомы.

Проект 26.24. Разнообразие структур терминальных районов хромосом млекопитающих (д.б.н. Н.С. Жданова).

Кариотипы видов близнецов Sorex granarius и Sorex araneus составлены практически из идентичных хромосомных плеч. Робертсоновские перестройки играли главную роль в эволюции их кариотипов.

Показано, что длинные теломеры S. granarius, содержащие в среднем 213 т.п.н. теломерного повтора, имеют характерную для функционирующих теломер ассиметрию G- / C-обогащенных нитей и повышенную, по сравнению с таковой в нормальных диплоидных клетках человека, частоту пострепликационных теломерных обменов (рис.). Данные свидетельствуют о том, что в них могут происходить рекомбинационные процессы. Было установлено, что длинные теломеры реплицируются, главным образом, в конце S-фазы. При этом мы наблюдали и вторую менее выраженную волну репликации теломерной ДНК в первой половинe S-фазы. Возможно, что ее наличие связано с репликацией фракции теломерной ДНК, которая в длинных теломерах перемежается с рибосомными повторами.

Рис. Метафазная пластинка первичных фибробластов Sorex granarius после CO-FISH с высокоспецифичной к G-обогащенной теломерной нити Cy3 меченой PNA пробой (CCCTAA)3. Окраска хромосом DAPI. Перед фиксацией клетки в течение 20 час культивировались с 5-бромдезоксиуридином. Стрелка указывает на теломерный обмен.

Проект 26.25. Молекулярно-генетические механизмы взаимодействия гонадотро-пинов и биогенных аминов в контроле оогенеза насекомых (д.б.н. И.Ю. Раушенбах).

Исследованы молекулярные механизмы возраст-специфичной взаиморегуляции дофамина (ДА) и гонадотропинов – ювенильного гормона (ЮГ) и 20-гидроксиэкдизона (20Э) в контроле репродуктивной функции дрозофилы. Впервые продемонстрировано, что ЮГ регулирует содержание ДА у молодых самок дрозофилы на уровне деградации амина, а у половозрелых на уровне его синтеза. 20Э регулирует содержание ДА как на уровне синтеза, так и на уровне деградации амина и у молодых и у зрелых самок, однако его эффекты разнонаправлены. Впервые с использованием генетической абляции части клеток железы, синтезирующей ЮГ (corpus allatum (CA)), установлено наличие единого контроля синтеза и деградации гормона: снижение/повышение синтеза ЮГ вызывает повышение/снижение его деградации (рис). Наличие такого механизма способствует адаптации дрозофилы, позволяя быстро изменять уровень гормона в стрессирующих условиях. Впервые продемострирована роль ДА рецепторов в регуляции дофамином метаболизма стресс-связанных гормонов и в развитии нейрогормональной стресс-реакции насекомых. Впервые установлено наличие полового диморфизма в молекулярных механизмах гормональной регуляции репродуктивной функции насекомых.

Рис. Влияние генетической абляции части клеток СА (верхний рисунок, железа показана стрелкой) на: активность ключевого фермента синтеза ЮГ (ЮГАМТ), уровень деградации (гидролиза) ЮГ, стресс-реактивность ЮГ, плодовитость и устойчивость самок к действию стрессора.

Проект 26.26. Анализ генетической детерминации интегрированных признаков организма с использованием методологии многомерной статистики и искусственных нейронных сетей. Поиск локусов, детерминирующих ковариацию поведения и морфологию у серебристочерных лисиц (д.б.н. А.Л. Маркель).

В работе использованы крысы уникальной линии НИСАГ с наследуемой индуцируемой стрессом артериальной гипертензией. Впервые был проведен сравнительный анализ экспрессии 22 тыс. генов в корковом и мозговом веществе почек, в стволе мозга и в гипоталамусе гипертензивных крыс НИСАГ (n = 3) и нормотензивных крыс WAG (n = 3) на микрочипах RatRef-12 Expression BeadChips, Illumina (USA). Проведение функциональной аннотации групп дифференциально экспрессирующихся генов и выявление метаболических путей, определяющих различия в функции разных органов гипертензивных крыс НИСАГ и нормотензивных крыс WAG проводилось впервые.

В описанных метаболических путях выявлены дифференциально экспрессирующиеся гены (табл.): в мозговом веществе почек в схеме метаболизма тирозина найдены изменения экспрессии генов Aox1 (aldehyde oxidase 1) и Comt (catechol-O-methyltransferase). Ген Comt кодирует фермент катаболизма катехоламинов, что обусловливает его участие в патогенезе стресс зависимой артериальной гипертонии.

Таблица. Дифференциально экспрессирующиеся гены в метаболических путях.

Ген Название гена Acc.# Соотношение экспрессии мРНК гена, НИСАГ/WAG Хромосома Mb
Почка корковое вещество: молекулы клеточной адгезии
Cldn16 claudin 16 NM_131905.1 0.51 11 76.3
Cldn9 claudin 9 NM_001011889.1 0.39 10 12.9
RT1-A1 RT1 class Ia, locus A1 NM_001008827.1 6.09 20 5.06
RT1-CE15 RT1 class I, CE15 NM_001008838.1 8.43 20 0.06
Почка мозговое вещество: молекулы клеточной адгезии
Cldn9 claudin 9 NM_001011889.1 0.30 10 12.9
RT1-A1 RT1 class Ia, locus A1 NM_001008827.1 7.82 20 5.06
RT1-Ba RT1 class II, locus Ba NM_001008831.1 0.27 20 4.70
метаболизм тирозина
Aox1 aldehyde oxidase 1 NM_019363.2 0.25 9 56.8
Comt catechol-O-methyltransferase NM_012531.1 0.22 11 84.6

Mb – положение гена на хромосоме, выраженное в мегабазах (миллионах нуклеотидов).

Проект 26.27. Молекулярно-генетическое изучение признаков, включенных в доместикацию у ди-, тетра- и гексаплоидных пшениц (чл.-корр. РАСХН Н.П. Гончаров).

Показано, что изученные виды и сорта пшеницы имеют полиморфизм в кодирующей части гена Q в позиции 329. Происходит замена нуклеотида А в позиции 2094 восьмого экзона на G, что в свою очередь приводит к смене аминокислоты Ile на Val. Анализ экспрессии Q гена показал, что формирование морфологии колоса зависит от уровня экспрессии гена. Построена пространственная структура Q белка, которая показала внешнее положение 329 аминокислоты, предположительно влияющей на уровень активности белка. Проведен филогенетический анализ и показано разделение образцов в соответствии с морфологией и наличием мутации в 329 позиции белка.

Таблица. Морфология колоса и вариабельная позиции 2094 в последовательности Q гена.

Проект 26.28. Механизмы стабилизации интрогрессивных форм мягкой пшеницы в зависимости от таксономической принадлежности источников чужеродного генетического материала (д.б.н. Л.А. Першина).

Показано, что хромосомы дикорастущего ячменя Hordeum marinum обладают компенсационной способностью по отношению к хромосомам мягкой пшеницы, а цитоплазма этого вида ячменя совместима с ядерным геномом мягкой пшеницы.

Рис. Результаты GISH-анализа аллоплазматической пшенично-ячменной дителосомной замещенной линии 7H1Lmar(7D). Зеленый цвет – хромосомы дикорастущего ячменя H. marinum.

Проект 26.29. Биоинформатика генетической изменчивости: исследование влияния мутаций на молекулярно-генетические системы организмов (акад. Н.А. Колчанов).

По данным анализа белок-кодирующей РНК реконструирована филогения ВИЧ-1, его связи с другими лентивирусами и развитие волн пандемии СПИД. Впервые обнаружена достоверная связь полиморфных вариантов ТАТА бокса ВИЧ-1 с режимами пандемии СПИД. Обнаружен достоверный ( < 10-31) избыток низкоаффинных форм ТАТА-бокса, что свидетельствует о глобальной тенденции отбора вариантов ВИЧ-1 с низким уровнем базальной экспрессии. Накопление субтипа E и рекомбинантов с ним, прежде всего в Юго-Восточной Азии (жирный пунктир на рис.) – часть этой тенденции. С ней пересекается другая тенденция, возможно связанная с адаптацией ВИЧ-1 к естественной гетеросексуальной трансмиссии (тонкий пунктир). Избыток этих вариантов ТАТА-бокса ассоциирует Францию с ее бывшими колониями (выделены жирным шрифтом на рис.) и с обменом ВИЧ-1 в границах прежней колониальной системы.

Рис. Анализ частот 146 вариантов TATA бокса ВИЧ-1 в 69 странах обнаружил две главные компоненты: F1 (58 % вариансы) и F2 (34 % вариансы). S0 – самый частый вариант «agatgctgCAТATAAgcagctgcttt» ТАТА бокса ВИЧ-1 (1567 из 2662 копий, 59 %, найденных в GenBank). Три пунктирные линии – оси трех кластеров, указывающих три режима пандемии ВИЧ-1. Франция и ее бывшие колонии выделены жирным шрифтом.

Проект 26.30. Полиморфизм природных популяций – влияние факторов внешней среды и взаимодействие генов и геномов (д.б.н. И.К. Захаров).

Получены ДНК-клоны из ДНК-библиотек центромерного района хромосомы 1 и локуса рибосомальной ДНК вида Chironomus plumosus из популяций Северной Америки, Восточной Европы и Сибири. Ведется секвенирование полученных ДНК-клонов. Проведено сравнение локализации ДНК-проб из центромерных районов хромосомы 3 Chironomus entis, полученных из географически изолированных популяций – неарктических и палеарктических. Показано, что имеются географические различия в локализации ДНК-проб: в неарктических популяциях Chironomus entis ДНК-проба из центромерного района хромосомы 3 локализуется во всех центромерных районах хромосом, а в палеарктических – ДНК-проба четко выявляется только в центромерных районах хромосом 1, 2 и 3, а сигнал в центромерном районе хромосомы 4 (G) либо слабый, либо не наблюдается.

Рис. FISH ДНК-проб из центромерного района хромосомы III, полученных из палеарктических и неарктических популяцих C. entis.

a) FISH ДНК-пробы pent3 (красный сигнал), полученной из палеарктической популяции, на хромосомы C. entis из палеарктической популяции.

b) FISH ДНК-пробы nent3 (зел?ный сигнал), полученной из неарктической популяции, на хромосомы C. entis из неарктической популяции.

Буквами обозначены плечи хромосом, стрелками отмечены центромерные районы.

Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН Б.21 Основы фундаментальных исследований нанотехнологий и наноматериалов (координатор акад. Ж.И. Алферов)

Проект 21.8. Разработка фундаментальных основ определения масс биополимеров, недоступных современным методам масс-спектрометрического анализа (акад. Н.А. Колчанов, к.б.н. С.Е. Пельтек).

Одной из ключевых задач масс-спектрометрического анализа является перевод анализируемых молекул в газовую фазу. Ранее нами показано, что с помощью метода мягкой неразрушающей абляции под действием терагерцового излучения можно перевести в газовую фазу водонерастворимые протеины, полисахариды и ДНК больших молекулярных масс и наночастицы различной природы с сохранением их первичной структуры. Для ионизации переведенных в газовую фазу биомакромолекул были изучены следующие методики: изучение заряда аблированных молекул без дополнительной ионизации; методики протонирования и депротонирования и методика химической ионизации. Основные усилия были направлены на изучение процессов протонирования и депротонирования биомакромолекул в водных растворах при изменении концентрации протонов.

Рис. а. Скорость падения заряда на обкладках при протонировании белка муравьиной кислотой.

Рис. б. Скорость падения заряда на обкладках при депротонировании белка NaOH.

Проект 21.63. Эллипсометрическое изучение закономерностей модуляции поверхностного плазмонного резонанса различными биологическими субстратами для разработки новых подходов к диагностике заболеваний человека (чл.-корр. РАМН М.И. Воевода).

Методами спектральной эллипсометрии и ИК-спектроскопии проведено исследование тонких пленок, полученных центрифугированием сыворотки крови здоровых людей и лиц, страдающих заболеваниями внутренних органов.

Показано, что спектральная эллипсометрия и ИК-спектроскопия представляют собой подходящие неразрушающие экспресс-методы скрининга, предварительной диагностики кро- ви у пациентов с патологией внутренних органов. Полученные эллипсометрические данные о наличии особенностей формирования биоорганических покрытий из сыворотки крови (толщина и равномерность нанесения пленки, показатель преломления – см. рис. 1) у пациентов с диффузной патологией печени, гиперлипидемиями, сахарным диабетом подтверждены выявленными изменениями тонкой структуры ИК-спектров (состав амидных полос поглощения – см. рис. 2).

Рис. 1. Дисперсионные зависимости n( ). Обр. No 1–4 для пленок всех четырех групп.

Рис. 2. Полосы поглощения ИК-спектра: амид I и амид II. Разложение на компоненты. Обр. No 1.

Проект 21.66. Исследование подавления экспрессии гена in vivo олигонуклеотидами, комплементарными к мРНК гена-мишени, иммобилизованными на наночастицах биодеградируемых полимеров радиационным способом (д.б.н. Н.Н. Дыгало).

Разработана тест-система, пригодная для определения апоптогенной активности препаратов, включая и короткие интерферирующие РНК, in vivo [Патент]. С помощью этой системы проведен анализ апоптогенной активности двухцепочечных РНК, состоящих из нативных и химически модифицированных 2’-О-метильных аналогов нуклеотидов, примененных in vivo без трансфектанта и в нанокомплексах с катионным липидом липофектамином. Проведен анализ необходимых условий получения радиационным способом наночастиц на основе олигосахаридов, содержащих олигонуклеотиды. Проведен анализ необходимых доз облучения, скорости набора дозы и условий проведения облучения на ускорителе электронов ИЛУ-6. Впервые установлена возможность сшивки олигонуклеотидов с полисахаридами методом электронно-лучевой технологии (рис.).

Рис. Сшивка олигонуклеотидов с полисахаридами методом электронно-лучевой технологии.

а – образец участка электрофореграммы олигонуклеотидов после облучения пучком электронов в дозе 2,5 kGr без (дорожка А) и в присутствии 2,5 мг/мл декстрана (дорожка В). На дорожке В полосы смещены к верху, к старту электрофореза, т. е. происходит их задержка в геле, что свидетельствует о сшивке олигонуклеотида с полисахаридом. Средняя полоса соответствует олигонуклеотиду длиной 404 пн.

b – участок графика денситометрии образцов, содержащих набор олигонуклеотидов в диапазоне 501–242 пн. Вертикальные линии отмечают индивидуальные олигонуклеотиды, длина которых указана цифрами в основании линий. Образцы, облученные пучком электронов в дозе 2,5 kGr без – линия А, и в присутствии 2,5 мг/мл декстрана – линия Б. Ассиметрия пиков кривой Б демонстрирует задержку в геле олигонуклеотидов, облученных совместно с декстраном.

c – сшивка олигонуклеотида с полисахаридом зависит от концентрации олигосахарида и дозы облуче- ния. Представлены данные для олигонуклеотида длиной 101 пн. Похожие зависимости получены для олигонуклеотидов в диапазоне от 26 до 501 пн. * достоверные отличия (p < 0,01 – p < 0,001) от всех групп, кроме группы, облученной дозой 2,5 kGr в присутствии 2,5 мг/мл декстрана.

Проекты Программы фундаментальных исследований Президиума РАН А.3. Химические основы энергетики (координатор акад. И.И. Моисеев)

Проект 3.19. Поиск, селекция и изучение перспективных бактериальных штаммовпродуцентов для переработки глицерина. Координатор проекта – акад. Н.А. Колчанов, к.б.н. В.А. Иванисенко.

Для изучения ферментов и метаболический путей бактерий-продуцентов разработана компьютерная система, обеспечивающая в автоматическом режиме аннотацию и анализ вновьсеквенированных геномов на уровне структурно-функциональной организации протеома и сетей молекулярно-генетических взаимодействий, включая метаболические, транспортные и регуляторные пути. Система включает более 20 программ, осуществляющих поиск гомологов по базам данных, реконструкцию пространственных структур белков, предсказание функциональных сайтов в белках, реконструкцию ассоциативных сетей (метаболические, транспортные, регуляторные и другие пути) и т. д. Реконструкция ассоциативных сетей поддерживается с использованием методов анализа последовательностей и пространственных структур белков, а также методов автоматического анализа научных публикаций text-mining (система ANDCell-ANDVisio).

Рис. Пример ассоциативной сети взаимосвязей 1,3-Propandiol в клетке бактерии, построенной с помощью системы ANDCell-ANDVisio. Метаболиты, белки и процессы изображены в виде треугольников, шариков и эллипсов, соответственно. Связи показаны в виде стрелок.

Результаты научно-исследовательских работ по программам Президиума СО РАН

Междисциплинарные интеграционные проекты Президиума СО РАН

Проект 7. Разработка генно-инженерной платформы нового поколения для экспрессии целевых генов в составе внеядерных геномов.

Координатор проекта – д.б.н. Е.В. Дейнеко, ИЦиГ СО РАН.

Создана генетическая конструкция с маркерными генами устойчивости к спектиноми цину (aadA) и зеленого флюоресцентного белка (gfp), а также сайтами введения целевых генов для экспрессии в хлоропластном геноме табака (рис. А). В результате биобаллистической трансформации с использованием «генной пушки» (рис. Б) получены клеточные линии табака, проявляющие устойчивость к антибиотику спектиномицину. На рисунке представлена GFP-флюоресценция суспензионной культуры клеток табака (рис. В). Отрабатывается методика разделения микрокластеров и получения моноклеточной суспензии для проточной цитометрии.

Рис. Этап создания генно-инженерной платформы нового поколения для экспрессии целевых генов в составе внеядерных геномов.

а. Кассета интеграции вектора pPS_XL_GFP . Кроме гена aadA присутствует ген gfp и места введения возможных генов. Введен модифицированный промотор PrrnG10L.

Проект 18. Комплексное исследование генетических, молекулярных и физиологических механизмов депрессии и разработка новых методов ее фармакологической коррекции. Роль наследственных изменений в цитокиновой и серотониновой системах мозга. Координатор проекта – д.м.н. Н.К. Попова, ИЦиГ СО РАН.

В результате исследования влияния нового потенциального психотропного препарата гидрохлорида 8-(трифторметил)-1, 2, 3, 4, 5-бензопентатиепин-6-амина на поведение и экспрессию ключевых генов, вовлеченных в регуляцию медиаторных систем мозга, у мышей линии ASC с наследственной предрасположенностью к каталепсии было показано, что острое введение препарата в дозах 10, 20 и 40 мг/кг и хроническое (16 дней) в дозе 10 мг/кг снижало выраженность каталепсии. Хроническое введение препарата достоверно понижало экспрессию генов, кодирующих белок gp130, в среднем мозге и гиппокампе, gp130, моноаминоксидазу А, тирозингидроксилазу в среднем мозге, 5-HT1A рецептора и глутаматдегидрогеназы в коре мозга. Полученные результаты свидетельствуют о способности препарата регулировать экспрессию генов медиаторных систем мозга и корректировать наследственную каталепсию.

Рис. Влияние циталопрама и пароксетина на основной показатель депрессивности – время неподвижности в тесте Порсолта у мышей конгенных линий. * p < 0,05,** p < 0,01 по сравнению с контролем.

Проект 58. Создание нового методического подхода для изучения регуляции и динамики процессов молекулярного переноса, определяющих водно-электролитный гомеостаз клетки. Координатор проекта – д.б.н. Е.И. Соленов, ИЦиГ СО РАН.

В методической части проекта созданы образцы квантовых точек нового поколения, предназначенные для создания молекулярных зондов-доноров в методах использующих резонансный перенос энергии (FRET). Создан лабораторный прототип микрофлуидной системы для исследования транспортных процессов в индивидуальных клетках. В теоретической части проекта достигнуто значительное повышение точности математической модели, интегрирующей трансмембранные потоки ионов в клетке в процессе адаптации к гипотонической среде. Разработаны методы определения оптимальных параметров математической модели с применением генетического алгоритма.

Рис. Моделирование реакции RVD. Зависимость относительного объема клетки (толстая линия – модель, тонкая – эксперимент с указанием стандартной ошибки (SE)). Верхняя шкала отражает изменение суммарной внеклеточной концентрации ионов (мМ).

Проект 73. Научные основы технологии выращивания и переработки нового вида целлюлозосодержащего сырья мискантуса китайского. Координатор проекта – академик В.К. Шумный, ИЦиГ СО РАН.

В рамках проекта в 2010 г. был проведен поиск источников целлюлозы многоцелевого использования (рис.1). Образцы травянистых растений отбирались по результатам анализов (влажность, экстрактивные вещества, лигнин, целлюлоза) и структуре урожая. Отобраны три образца Леймуса (Колосняк), два образца Канареечника и один – Сида. В качестве стандарта был использован Мискантус китайский (рис. 2).

Исследована реакционная способность к ферментации биомассы мискантуса и продуктов ее обработки промышленными целлюлозными комплексами и мультиэнзимными композициями, а также условия получения карбоксиметилированной целлюлозы твердофазным и суспензионными способами. Определены основные свойства целевых продуктов.

Рис. 1. Беленая целлюлоза (делигнификация в автоклаве и отбелка) (А) и лигнин (Б), полученные из Мискантуса китайского. Содержание целлюлозы в биомассе Мискантуса составляет 44 %, лигнина – 4–17 %.

Рис. 2. Слева: июньские всходы мискантуса после посадки во второй половине мая; справа: восьмилетняя плантация мискантуса в августе.

Рис. 2. Слева: июньские всходы мискантуса после посадки во второй половине мая; справа: восьмилетняя плантация мискантуса в августе.

Проект 91. Функция почки как интегрального механизма регуляции артериального давления при артериальной гипертонии: экспериментальное исследование, математическое и компьютерное моделирование.

Координаторы проекта – акад. Л.Н. Иванова, ИЦиГ СО РАН; д.ф.-м.н. А.М. Блохин, ИМ СО РАН

В используемой нами модели гипертонической болезни – у крыс линии НИСАГ (ISIAH) обнаружено достоверное повышение активности ангиотензин превращающего фермента. Это является доказательством вклада ренин-ангиотензиновой системы в патогенез стресс-зависимой формы артериальной гипертонии.

Проект 94. Сигнальное и диагностическое значение летучих продуктов метаболизма.

Координатор проекта – д.б.н. М.П. Мошкин, ИЦиГ СО РАН. В работах, выполненных в ИСиЭЖ СО РАН и Университете Тохоку (Япония), было установлено, что запах половозрелых самок вызывает у самцов мышей миграцию лейкоцитов в верхние дыхательные пути (рис.). Это, как показали исследования ИСиЭЖ и ИХБиФМ СО РАН, приводит к многократному повышению устойчивости мышей к возбудителям респираторных заболеваний, в частности к вирусу гриппа (рис.). Таким образом, сигнал к размножению стимулирует не только сопряженный с риском заражения обонятельный поиск половых партнеров, но и одновременно усиливает иммунное противостояние этому риску. Изучение сигнальной иммуномодуляции, продолженное в ИЦиГ СО РАН, указывает на возможность усиления иммунитета верхних дыхательных путей без участия провоспалительных цитокинов (рис.).

Рис. Реакция иммунной защиты верхних дыхательных путей на запаховые стимулы – новый пример сигнальной адаптации к повышению инфекционных рисков при обонятельном поиске половых партнеров.

На схеме зелеными стрелками показаны известные ранее функциональные связи, темно-вишневой стрелкой – вновь установленная связь хемосигналов и механизмов неспецифического иммунитета. 1 – увеличение общего числа лейкоцитов, макрофагов и нейтрофилов в смывах легких при экспозиции самцов мышей запахом половозрелых самок.

2 – кумулятивные кривые смертности при респираторном заражении возрастающими дозами вируса гриппа. Доза вируса выражена в Log фокус образующих единиц (ФОЕ). У самцов, изолированных от самок, 50 процентная смертность (ЛД50) составила 3,28 ± 0,35 LogФОЕ, а у самцов, получавших хемосигналы самок, 4,73 ± 0,30 LogФОЕ.

3 – миграция лейкоцитов в верхние дыхательные пути, содержание интерлейкина-1 (IL-1) в ткани легких и концентрация кортикостерона в плазме крови самцов мышей при закапывании в нос 10 мкл растворов, содержащих: компонент бактериальной стенки – липополисахарид (ЛПС), мочу самок или их комбинацию.

Проект 119. Постгеномная биоинформатика: компьютерный анализ и моделирование молекулярно-генетических систем. Координатор проекта – акад. Н.А. Колчанов, ИЦиГ СО РАН.

Разработаны математические модели биосинтеза пиримидиновых и пуриновых нуклеотидов de novo у E. coli, описывающие нелинейные механизмы протекания ферментативных реакций с учетом негативной аллостерической регуляции активности ферментов продуктами биосинтеза (рис. 1). Показано, что в системе биосинтеза пиримидинов, характеризующихся наличием большого числа негативных регуляторных петель (рис. 1, слева), реализуются оба режима функционирования: стационарный и осциллирующий (рис. 2, а). Обнаружено, что длительность периода колебаний концентраций метаболитов пропорциональна длине клеточного цикла (рис. 2, б). На рис. 3 представлен фазовый портрет поведения модели биосинтеза пиримидинов в координатах концентраций предшественников их синтеза, карбамоилфосфата и дигидрооротата. Для системы биосинтеза пуринов, характеризующейся другой структурой негативных регуляторных петель (рис. 1, справа), при любых наборах физиологических параметров реализуется только стационарный режим функционирования.

Рис. 1. Схема биосинтеза пиримидиновых (слева) и пуриновых (справа) нуклеотидов de novo у E.coli. Черные пунктирные стрелки – ферментативные реакции, протекающие в анаэробных условиях. Красные – ингибирование, зеленые – активация соответствующих ферментативных реакций. Vj (j=1...25) – скорость ферментативных реакций; Xl (l=1...21) – переменные модели.

Рис. 2. (А) Динамика изменения концентраций пиримидиновых нуклеотидов и их предшественников в модели биосинтеза пиримидинов в зависимости от времени. (В) Зависимость периода колебаний (сек) концентраций метаболитов от длины клеточного цикла .

Рис. 3. Фазовый портрет поведения модели биосинтеза пиримидинов, представленный в координатах концентраций Carbamoyl phosphate (ось Х) и Dihydroorotate (ось Y). Точка показывает начальные значения количества этих молекул.

Интеграционные проекты со сторонними научными организациями

Проект 27. Молекулярные механизмы гормональной регуляции численности насекомых в нормальных и неблагоприятных условиях среды.Координатор проекта – д.б.н. Н.Е. Грунтенко, ИЦиГ СО РАН.

Впервые продемонстрировано, что онтогенетическое изменение направления влияния дофамина (ДА) на метаболизм гонадотропных гормонов насекомых связано с перепрограммированием жирового тела (места синтеза ферментов деградации ювенильного гормона (ЮГ)) и изменением в нем числа Д2-подобных рецепторов (DD2R): число DD2R иммунореактивных клеток в жировом теле молодых самок в несколько раз превышает таковое у половозрелых особей (рис). Впервые доказано, что влияние ДА на 20-гидроксиэкдизон (20Э) опосредуется ЮГ: в яичниках (месте синтеза 20Э) DD2R иммунореактивные клетки отсутствуют. Впервые установлено, что ингибирующее влияние ДА на синтез ЮГ опосредуется DD2R: снижение экспрессии гена DD2R в железе, синтезирующей ЮГ, приводит к повышению синтеза гормона.

Рис. Слева – DD2R иммунореактивные клетки (зеленый сигнал) в жировом теле молодых и половозрелых самок дикого типа (линия Canton S) D. melanogaster; справа – схема взаимодействия ДА с ЮГ и 20Э (экдизоном). ЮГЭ – ЮГ-эстераза, фермент, деградирующий ЮГ.

Проект 28. Исследование молекулярно-генетических механизмов стрессоустойчивости растений и восстановления фертильности гибридов с помощью методов хромосомной, генной и метаболической инженерии. Получение новых высокоадаптивных форм хозяйственноценных растений. Координаторы проекта – к.б.н. А.В. Кочетов, ИЦиГ СО РАН; д.б.н. Л.А. Першина ИЦиГ СО РАН; д.б.н. В.И. Малиновский, БПИ ДВО РАН, г. Владивосток.

В рамках проекта исследуются молекулярные механизмы стрессоустойчивости с помощью методов хромосомной и генной инженерии. За отчетный период впервые показано, что экстраклеточные рибонуклеазы увеличивают устойчивость трансгенных растений к рабдовирусу ожога гречихи – фитопатогену, поражающему ряд сельскохозяйственных культур (рис.; работа выполнена совместно с НБС НАН Украины и БПИ ДВО РАН). Полученный результат доказывает, что экстраклеточные рибонуклеазы являются противовирусными агентами широкого спектра действия, что расширяет современные представления о биологических функциях этого класса белков у растений.

Рис. а – трансгенные растения Nicotiana tabacum SR1, экспрессирующие ген рибонуклеазы А Bos taurus, инокулированные вирусом ожога гречихи; б – спектр белков с рибонуклеазной активностью у трансгенных (левая дорожка) и контрольных (правая дорожка) растений (интенсивность сигнала соответствует содержанию белков с рибонуклеазной активностью); в – нетрансгенные растения, инокулированные вирусом ожога гречихи. Видно, что в отличие от контроля у трансгенных растений вирус после инокуляции практически не распространился на верхние листья.

Проект 48. Регуляция пролиферативной активности и дифференцировки стволовых клеток позвоночных и беспозвоночных животных. Координатор проекта – д.б.н. О.Л. Серов, ИЦиГ СО РАН.

Установлено, что импринтированный геномный локус Dlk1-Dio3 является важным индикатором полноты перепрограммирования геномов соматических клеток при использовании технологии индукции в них плюрипотентности с помощью экзогенной экспрессии транскрипционных факторов (технология получения iPSC–induced pluripotent stem cells). Уровень метилирования этого региона коррелирует с уровнем плюрипотентности iPSC; его гиперметилирование коррелирует с существенным снижением потенциала, что отражает неполное перепрограммирование. Разработана технология перепрограммирования генома соматических клеток путем их слияния с эмбриональными стволовыми (ЭС) клетками. Впервые установлено, что в гибридных клетках, полученных слиянием ЭС клеток и фибробластов, уровень метилирования межгенного дифференциально метилированного региона локуса Dlk1-Dio3 соответствует уровню метилирования в нормальных клетках (~30–50 %). Таким образом, технология слияния ЭС клеток с соматическими обеспечивает полное перепрограммирование генома фибробласта.

(Приоритетное направление РАН VI.49.; Программа СО РАН VI.49.1.1; ИЦиГ СО РАН; д.б.н. О.Л. Серов).

Рис. Уровень метилирования МГ-ДМР локуса Dlk1-Dio3 в ЭС клетках мыши, фибробластах и клонах гибридных клеток: taf2, taf5, tef4 и tef9 относительно стволовых клеток (*) с индуцированной плюрипотентностью: iPS1, iPS2, iPS3 (по данным Stadtfeld et al., 2010).

Проект 59. Трехмерные культуры клеток: исследование культивирования стволовых и первичных клеток с целью получения дифференцированной хрящевой ткани, пригодной для заместительной терапии. Координатор проекта – д.б.н. С.М. Закиян, ИЦиГ СО РАН.

Исследована способность индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) к направленной дифференцировке в хрящевую ткань. Показано, ИПСК эффективно проходят направленную хондрогенную дифференцировку в условиях подобранных ранее для эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Установлено, что присутствие в хондрогенной среде при хондрогенной дифференцировке ИПСК и ЭСК ростового фактора TGF-b1 увеличивает долю клеток экспрессирующих исключительно коллаген 2 (70–90 % позитивных клеток), тогда как при использовании BMP2 доля клеток, экспрессирующих коллаген второго типа дотигает лишь 45–60 %, а доля клеток экспрессирующих коллаген 1 составляет около 50 %, что характерно для фиброзной хрящевой ткани. Кондиционная среда синовиальных фибробластов, способствует поддержанию паттерна экспрессии, характерного для хрящевой ткани, обеспечивает гомеостаз хряща при длительном культивировании in vitro, но не влияет на процесс хондрогенной дифференцировки.

Рис. Самосборка хрящевой ткани in vitro из производных, полученных в результате направленной хондрогенной дифференцировки ИПСК. Хрящеподобные образования, сформировавшиеся через четыре недели самосборки.

Проект 84. Исследование репродуктивного потенциала и его гормональной регуляции у мужчин европейского и азиатского севера в связи с изменениями среды обитания. Координатор проекта – д.б.н. Л.В. Осадчук, ИЦиГ СО РАН.

Изучена региональная и этническая изменчивость качества спермы и гормонального статуса в выборке из 600 мужчин активного репродуктивного возраста из городов Архангельска, Новосибирска, Кемерово и Улан-Удэ. Установлено, что мужчины г. Архангельска имеют наилучшие показатели спермограммы по отношению к референсным значениям ВОЗ (2001). На примере жителей г. Улан-Удэ показаны возрастные различия в тестикулярной функции между бурятами и европеоидами, направленные на поддержание оптимальной фертильности спермы у этих этнических групп. Загрязнение окружающей среды, образ жизни, питание, вредные привычки, ИППП и социальное ограничение рождаемости могут быть причиной установленных различий.

Рис. Показатели фертильности спермы у мужчин гг. Архангельска (Арх), Новосибирска (Нов), Кемерово (Кем) и Улан-Удэ (Ул-Удэ). * достоверность различий между регионами РФ, горизонтальной чертой на рисунках обозначены референсные значения ВОЗ (2001).

С использованием электронной и иммуно-флуоресцентной микроскопии проведен детальный анализ синапсиса и рекомбинации хромосом у гибридов между видами близнецами Microtus arvalis и M. rossiaemeridionalis, различающимся по нескольким хромосомным перестройкам. Показано, что у самцов гибридов мейоз останавливается на границе между лептотеной и зиготеной. Осевые элементы синаптонемных комплексов формируются нормально, однако их синапсис оказывается нарушенным не только в перестроенных, но и в неперестроенных хромосомах. Это указывает на нехромосомную природу гибридной стерильности. Удалось идентифицировать нарушения мейоза, обусловливающие стерильность гибридов между видами близнецами Microtus arvalis и M. rossiaemeridionalis, и показать, что они выражены значительно сильнее у самцов, чем у самок, и не связаны с хромосомной дивергенцией.

Рис. Микрофотографии распластанных препаратов сперматоцитов (а, б) и ооцитов (в, г) гибридов между Microtus arvalis и M. rossiaemeridionalis после иммуноокрашивания с использованием антител к белкам SCP3, SCP1, H2AX, RAD51 и MLH1

Проект 129. Молекулярно-генетические и цитологические основы формирования и стабилизации рекомбинантных геномов злаков. Координаторы проекта – д.б.н. Е.А. Салина, ИЦиГ СО РАН, акад. НАНБ Л.В. Хотылева, ИГиЦ НАН Беларуси.

Интрогрессивная гибридизация является эффективным подходом для расширения генетического разнообразия возделываемых злаков, в том числе и тритикале. Для выявления линий тритикале с интрогрессиями от дикорастущих злаков было проведено генотипирование десяти линий, полученных от скрещивания гексаплоидных тритикале с линиями мягкой пшеницы сорта Аврора, у которых геном D замещен соответственно на геномы Aegilops umbellulata, Ae. speltoides и Amblyopyrum muticum. Установлено, что одна гибридная линия характеризуется замещением хромосомы 1R на хромосому 1U Ae. umbellulata, другая имеет замещение 2R(2U) (рис. А, Б). Выявлены линии несущие транслокации от Ae. speltoides в коротком плече хромосомы 1B и в длинном плече хромосомы 7B (рис. В). Линии тритикале с транслокацией T7BS•7SL и с хромосомным замещением 1R(1U) представляют интерес для дальнейшей селекции на повышение зимостойкости и улучшения хлебопекарных качеств тритикале.

Рис. А – идентификация методом геномной in situ гибридизации хромосом ржи (зеленые) и хромосом Ae. umbellulata (красные - U) в гибридной линии тритикале; Б – детекция замещения хромосомы 2R ржи на хромосому 2U Ae. umbellulata с применением маркера хромосомы 2R (указан стрелкой): а – линии тритикале (11 – линия с замещением 2R(2U)), б – замещенные линии пшеницы сорта Аврора (хромосомы ржи отсутсвуют), в – родительские сорта тритикале; В – идентификация перестроек в хромосоме 1B (1) и транслокации T7BS•7SL (2) в гибридных линиях тритикале по распределению маркеров pSc119.2(красный цвет) и Spelt1 (отмечен *): а – хромосомы пшеницы, б – гибридные линии, в – Ae. speltoides.

Проект 148. Лазерная диагностика канцерогенеза с использованием измерения преломления и флуоресцентной спектроскопии. Координатор проекта – д.б.н. Т.Г. Амстиславская, ИЦиГ СО РАН.

Целью проекта является фундаментальное исследование взаимодействия лазерного излучения с биологическими тканями и создание на базе метода лазерно-индуцированной флюоресценции (ЛИФ) интегральной оценки физико-химических показателей, свидетельствующих о состоянии органов и тканей, в том числе о наличии канцерогенеза. Отличительны ми особенностями данной работы являются: а) использование собственной флуоресценции биологических тканей без использования каких-либо красителей; б) возбуждение ЛИФ ультрафиолетовым излучением. Отработана процедура лазерного облучения клеток и тканей импульсно-периодическим лазером с оптопараметрической перестройкой длины волны в диапазоне 210–355 нм для последующего изучения влияния ультрафиолетового излучения. В качестве модели использовали клетки перевиваемой опухоли Кребс 2. После облучения исследовали процент погибших клеток. Установлено, что воздействие ультрафиолетовым излучением любой длины волны дозой менее 0,1 Дж/см2не приводит к существенным повреждениям клеток, а дозой менее 1 Дж/см2 приводит к гибели незначительного их числа.