2006 год

Важнейшие результаты 2006 год

ИЛЛЮСТРАТИВНОЕ КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ВАЖНЕЙШИХ РЕЗУЛЬТАТОВ ЗАВЕРШЕННЫХ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработана база данных GenSensor, которая предназначена для накопления информации, необходимой для создания геносенсорных конструкций на основе бактериальных генов. Она содержит данные о структуре бактериальных промоторов, экспрессия которых активируется в ответ на определенное внешнее воздействие. На основе имеющейся в базе информации, разработана и создана конструкция геносенсора для регистрации наличия в тестируемой среде агентов, нарушающих как структуру ДНК, РНК и белков, так и физиологический гомеостаз клетки в целом. В его основе лежит промотор гена yfiA E. coli. Проведено тестирование чувствительности созданной конструкции в модельных экспериментах по изменению условий окружающей среды. Показана как полифункциональность созданного геносенсора (реакция на H2O2, фенол, митомицин С), так и высокая чувствительность на специфическое повреждение ДНК (мутагенность) (рис. 1). (Приоритетное направление РАН - 5.3.; Программа СО РАН - 24.1.; ИЦиГ СО РАН).

Рис. 1. Влияние Н2О2 (1), фенола (2) и митомицина С (3) на флуоресценцию клеток E. coli, трансформированных репортерной плазмидой pYfi-GFP в сравнении с контрольными клетками (4).

Открыт уникальный ген дрозофилы - SuUR, мутации которого супрессируют недорепликацию ДНК в районах прицентромерного и интеркалярного гетерохроматина. В этих же районах локализован белок SUUR. Ген клонирован, изучена его молекулярная организация: его N-концевая часть необходима для связывания с хроматином, с С-концевая часть отвечает за недорепликацию ДНК. С помощью метода microarray и использования линий с разными дозами гена SuUR получены данные, свидетельствующие в пользу координированной регуляции репликации и транскрипции генов в районах интеркалярного гетерохроматина. О степени координированности работы генов можно судить по уровню представленности ДНК в районе. На рис. 2 показан один из районов локализации кластера таких генов. Таким образом, ген SuUR является важным фактором, контролирующим репликацию ДНК в районах генетического сайленсинга. (Приоритетное направление РАН - 5.4.; Программа СО РАН - 21.1.; ИЦиГ СО РАН).

Рис. 2. Профили политенизации участка 19Е Х-хромосомы в зависимости от дозы гена SuUR.
По оси абсцисс - физическая карта района с обозначениями в тысячах пар нуклеотидов. По оси ординат - уровень политенизации от 0 до 100 %.
Треугольниками обозначена представленность ДНК у мутантов SuUR (0 доз белка), черными кружками - в диком типе (2 дозы белка SUUR), белыми кружками - у трансгенных особей, содержащих 2 нормальных дозы белка SUUR и 2 трансгенных. 
Под осью абсцисс стрелками показана локализация генов по направлению транскрипции, над ними - номера генов.

На основе совокупного сравнительного анализа геномов большого числа видов плацентарных млекопитающих из суперотрядов Afrotheria, Xenarthra, Euarchontoglires и Laurasiatheria, выполненного с помощью метода хромосомного пэйнтинга (ZooFISH), впервые реконструировано предковые геномы каждого из суперотрядов и плацентарных в целом (рис. 3). В безусловную заслугу проведенных современных исследований, выполненных с помощью методов молекулярной биологии, следует отнести построение консолидирующего филогенетического древа млекопитающих и ответ практически на все вопросы, на которые ни классическая систематика, ни палеонтология не способны были найти объяснения. (Приоритетное направление РАН - 5.3.; Программа СО РАН - 21.1.; ИЦиГ СО РАН).

Рис. 3. Реконструкция наиболее вероятной структуры генома предка плацентарных млекопитающих. 
Вверху - внешний вид предока млекопитающих. 
Слева - пример присутствия фрагментов гомологичных хромосомам человека 3 и 21, как одной из известных ассоциаций предкового генома. Данные хромосомной живописи и генетического (физического) картирования. Присутствие такой ассоциации отмечено у большинства видов млекопитающих и, даже, у птиц. 
Справа - вероятная структура предкового генома плацентарных млекопитающих с числом хромосом 2n = 46, для каждой хромосомы показана ее гомология с хромосомами человека.

Методом агробактериального переноса с использованием штамма LBA4404 Agrobacterium tumefaciens созданы трансгенные растения моркови с геном ИЛ18 человека (рис. 4а, б, в). Наличие в геноме трансгенных растений моркови фрагментов, соответствующих генам ИЛ10 и ИЛ18 человека, подтверждали методом ПЦР. На основании результатов анализа белковых экстрактов из корнеплодов трансгенных растений моркови с использованием поликлональной антисыворотки кролика против интерлейкина-18 человека установлено, что рекомбинантный белок соответствует зрелой форме интерлейкина-18 человека. Исследована биологическая активность рекомбинантного интерлекина 18 человека, накапливаемого в тканях генетически модифицированных растений моркови. Установлено, что пероральное введение трансгенной моркови с геном ИЛ-18 достоверно стимулировало продукцию IFN- спленоцитами лабораторных животных (рис. 4г), что может способствовать развитию иммунного ответа Тх1 типа. Данная работа выполнялась совместно с Институтом химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН. (Приоритетное направление РАН - 5.3.; Программа СО РАН - 20.2.; ИЦиГ СО РАН).

   

Рис. 4. Трансгенные растения моркови: растения-регенеранты (а и б) и корнеплоды Т0 (в), стимуляция продукции IFN-? спленоцитами мышей (г). 
Обозначения: интактная группа - обычный рацион кормления; контрольная группа - добавление нетрансгенной моркови к обычному рациону; опытная группа - добавление трансгенной моркови к обычному рациону. Спонтанная - накопление IFN- без стимуляции; стимулированная - накопление IFN- при стимуляции конканавалином А.

Создана детальная цитогенетическая карта хромосом американской норки включающая 166 генов и маркерных последовательностей ДНК (рис. 5). Эта карта может быть использована для разработки оптимальных стратегий селекции и разведения данного вида пушных зверей. Кроме того, ее сравнение с генетическими картами других видов может пролить свет на закономерности эволюции геномов млекопитающих. (Приоритетное направление РАН - 5.19.; Программа СО РАН - 21.3.; ИЦиГ СО РАН).

Рис. 5. Генетическая карта американской норки. Генетическая карта американской норки включает 127 генов (черный текст) и 39 микросателлитных последовательностей (красным текст). Разным цветом выделены районы хромосом норки гомологичные хромосомным районам человека по данным

Впервые получены жизнеспособные и стабильные 16-хромосомные тетрасомики гороха, у которых дополнительные хромосомы планируется превратить в хромосомные векторы, используемые для переноса хозяйственно-ценных генов (рис. 6). (Приоритетное направление РАН - 5.19.; Программа СО РАН - 21.1.; ИЦиГ СО РАН).

 

Рис. 6. (Слева) Метафаза митоза в молодом венчике тетрасомика гороха. (Стрелками указаны дополнительные хромосомы). (Справа) Профаза мейоза I в материнской клетке пыльцы тетрасомика гороха. (Стрелками указаны униваленты двух копий дополнительной хромосомы).

Впервые установлено, что белок GAGA, кодируемый геном Trl Drosophila melanogaster, требуется для поддержания структуры актинового цитоскелета. Структура актинового цитоскелета влияет на важнейшие клеточные процессы, такие как изменение морфологии, дифференцировка, цитокинез, обеспечение транспорта РНК, белков и цитоплазматических органелл. Анализ мутаций, затрагивающих 5'область гена, показал, что резкое снижение экспрессии GAGA приводит к стадиеспецифическим нарушениям структуры цитоплазматических актиновых филаментов в половых клетках яичников. Нарушения выявляются, начиная со стадии быстрого транспорта цитоплазмы питающих клеток в ооцит. Тогда как в норме актиновые филаменты протягиваются от поверхности питающих клеток к ядрам, удерживая ядра в центре клетки (рис. 7А, Б), у мутантов цитоплазматические актиновые филаменты практически отсутствуют, что приводит к забиванию кольцевых канальцев ядрами питающих клеток (рис. 7В, Г). В результате питающие вещества не полностью переносятся из питающих клеток в ооцит и из отложенных дефектных яиц не развивается потомство. (Приоритетное направление РАН - 5.5.; Программа СО РАН - 20.1.; ИЦиГ СО РАН).

Рис. 7. Влияние мутаций гена GAGA на структуры цитоплазматических актиновых филаментов в половых клетках яичников. 
Яйцевая камера самок дикого типа (А, Б). (А) Яйцевая камера на стадии быстрого транспорта. (Б) Эта же камера при большем увеличении. Треугольниками указаны актиновые филаменты. Яйцевая камера самок Trl мутанта (В, Г). (В) Цитоплазматические актиновые филаменты полностью отсутствуют в питающих клетках. (Г) Ядра питающих клеток проникают в кольцевые канальцы (указаны стрелками). Я - ядра питающих клеток.

Изучена дивергенция инверсионных последовательностей дисков политенных хромосом у 24 видов-эндемиков рода Chironomus из Австралии и Новой Зеландии в дополнение к ранее изученным последовательностям дисков у видов Chironomus из Евразии и Северной Америки. Исследование этой дивергенции показывает роль хромосомных перестроек (изменение линейной структуры генома) в микроэволюционном процессе. Компьютерный анализ эволюции последовательностей дисков в родеChironomus у видов на разных континентах показал, что австралийские виды образуют четкий отдельный кластер на NJ-филогенетическом дереве (рис. 8) что демонстрирует наличие континент-специфических хромосомных инверсий и соответственно указывает на важную роль хромосомных перестроек в дивергенции видов.(Приоритетное направление РАН - 5.21.; Программа СО РАН - 21.2.; ИЦиГ СО РАН).

Рис. 8. NJ-филогенетическое AEF-дерево, основанное на анализе попарного сходства последоват ельностей дисков в трех хромосомных плечах (A, E, F) политенных хромосом у 84 видов рода Chironomus.

Виды входят в состав 9 групп видов-двойников: plumosus, tenuistilus, riihimakiensis, obtusidens, decorus, aberratus, albimaculatus, pilicornis, piger. plu, tnu, rii, obt, dec, abe, alb, pil, pig - символы групп видов-близнецов, соответственно. По структуре кариотипа виды объединяются в 4 цитокомплекса: thummi, camptochironomus, pseudothummi, maturus. thu, cam, pst, mat - символы цитокомплексов, соответственно. Виды распространены в различных зоогеографических зонах: Палеарктической, Неарктической, Голарктической, Австралийской, Эфиопской. p, n, h, a, e - символы зоогеографических зон, соответственно.

Принципиальной причиной неспособности иммунной системы человека элиминировать патоген при хронических инфекциях вирусами иммунодефицита человека (ВИЧ), а также гепатита С и В, является так называемое функциональное истощение вирус-специфичных цитотоксических CD8 T-лимфоцитов (ЦТЛ). Истощение выражается в неспособности ЦТЛ отвечать на воздействие антигена пролиферацией и продукцией цитолитических медиаторов и агентов. Недавно было установлено, что дисфункция ЦТЛ обусловлена избыточной экспрессией рецепторов, ингибирующих фосфорилирование внутриклеточных сигнальных белков. Одним из таких рецепторов является PD-1. Обнаружено, что блокирование функции PD-1 приводит к частичному восстановлению функциональной активности ЦТЛ у ВИЧ- и гепатит С-инфицированных пациентов. Эти данные открывают принципиально новые пути эффективного лечения хронических вирусных инфекций. Нами впервые идентифицирован еще один ингибирующий рецептор ЦТЛ. Ген этого рецептора, названного FCRL6/IFGP6 селективно экспрессируется ЦТЛ клетками. Подавление экспрессии гена FCRL6 при митогенной стимуляции ЦТЛ in vitro, а также при развитии ряда аутоиммунных заболеваний указывает на то, что этот рецептор регулирует терминальную дифференцировку ЦТЛ. Проведенное совместно и ГНЦ "Вектор" изучение экспрессии гена в лимфоцитах доноров с поздней (IV) стадией развития ВИЧ-инфекции позволила впервые продемонстрировать, что у большинства исследованных доноров с признаками СПИД уровень экспрессии гена в 2-6 раз превышает норму (рис. 9). Полученные данные делают FCRL6 потенциальной мишенью для терапии ВИЧ-инфекции. (Приоритетное направление РАН - 5.7.; Программа СО РАН - 21.3.; ИЦиГ СО РАН).

Рис. 9. Дифференциальная экспрессия гена FCRL6 при заболеваниях, характеризующихся гиперактивацией (аутоиммунные заболевания) и истощением цитотоксических лимфоцитов (хронические вирусные инфекции). 
Обозначения: РС - рассеянный склероз, РА - ревматоидный артрит, СКВ - системная красная волчанка, ВИЧ - инфекция вирусом иммунодефицита.

У крыс со стресс-чувствительной артериальной гипертонией (линия НИСАГ) с помощью микросателлитных ДНК-маркеров завершено сканирование всех хромосом (рис. 10). Обнаружен ряд генетических локусов, связанных с формированием гипертензивного статуса, как с повышенным артериальным давлением, так и с другими признаками, сопутствующими развитию артериальной гипертонии, такими как нейро-гормональные изменения, морфологические особенности, характеристики поведения.(Приоритетное направление РАН - 5.13.; Программа СО РАН - 22.1.; ИЦиГ СО РАН).

Рис. 10. Микросателлитные ДНК-маркеры (указаны стрелками) и идентифицированные локусы, связанные с гипертензивным состоянием (показаны звездочками), на хромосомах крысы.

С использованием QTL-анализа (Quantitative Trait Loci - локусы количественных признаков) изучена молекулярно-генетическая природа поведения серебристо-черных лисиц. Выявлены первые QTLs, вовлекаемые в регуляцию Главных Компонент, или независимых комбинаций коррелируемых между собой параметров поведения (рис. 11)(Приоритетное направление РАН - 5.19.; Программа СО РАН - 21.3.; ИЦиГ СО РАН).

Рис. 11. Результаты QTLкартограф-анализа. На диаграмме представлены локусы, отвечающие за основные характеристики доместикационного поведения, сформировавшегося у лисиц в процессе их доместикации (длительного отбора по поведению).

Впервые продемонстрировано, что сиквенс-специфическое снижение числа рецепторов норадреналина 2А типа антисмысловым олигонуклеотидом (антисенсом) повышает экспрессию каспазы 3 в коре новорожденных крысят (рис. 12). В тоже время компенсирующей фармакологической стимуляцией сниженного антисенсом числа рецепторов можно добиться нормализации экспрессии этого фермента апоптоза в критический период формирования коры мозга млекопитающих. Полученные данные свидетельствуют о способности обычных условий раннего онтогенеза, таких, как стресс или недостаточная материнская забота, изменяющих экспрессию рецептора, влиять на программируемую гибель клеток формирующегося мозга. (Приоритетное направление РАН - 5.18.; Программа СО РАН - 21.3.; ИЦиГ СО РАН).

Рис. 12. Экспрессия протеазы апоптоза - каспазы 3 негативно регулируется рецептором норадреналина 2А типа в критический период формирования коры мозга млекопитающих. Сиквенс-специфическое снижение числа рецепторов норадреналина 2А типа антисмысловым олигонуклеотидом (антисенсом) повышает экспрессию каспазы 3 в коре новорожденных крысят. Компенсирующая фармакологическая стимуляция сниженного антисенсом числа рецепторов нормализует экспрессию этого фермента апоптоза.

Установлено, что отсутствие нейрогипофизарного гормона вазопрессина принципиально меняет динамику роста карциносаркомы у крыс. Введение клеток карциносаркомы Walker 256 у нормальных крыс WAG вызывает формирование солидной опухоли с летальным исходом. У вазопрессин-дефицитных крыс Браттлборо наблюдается быстрый переход опухоли в стадию регрессии с исчезновением опухолевых узлов. Впервые обнаружено, что интенсивность роста опухоли у нормальных крыс WAG зависит от состояния гидратации: при содержании на безводном режиме, стимулирующем секрецию вазопрессина скорость роста оказалась значительно выше, чем при хронической гидратации (рис. 13). У вазопрессин-дефицитных крыс Браттлборо эффекта дегидратации не наблюдалось. Таким образом, впервые показано, что уровень циркулирующего в крови вазопресина является наиболее существенным фактором, стимулирующим рост опухоли. (Приоритетное направление РАН - 5.7.; Программа СО РАН - 21.3.; ИЦиГ СО РАН).

Рис. 13. Динамика роста солидной опухоли у крыс линий WAG и Brattleboro после инъекции суспензии клеток Walker 256. Экспериментальные группы: 1 - гидратированные крысы (питье 4 % сахарозы без доступа к плотной пище); 2 - дегидратированные крысы (содержание на сухом корме без доступа к воде). Распаивание и сухоядение через каждые 3 дня прерывалось на сутки с переводом животных на нормальный рацион со свободным доступом к воде. Достоверность различий между дегидратированными и гидратированными крысами WAG, * р < 0,05. ** р < 0,01.

С использованием разработанной ранее этологической модели социального доминирования с минимальным социумом у самцов лабораторных мышей, была установлена ранговая асимметрия по элементам пищевого, полового и маркировочного поведения, которая совпадала с таковой в агонистическом тесте. Интенсивность пищевого, полового и маркировочного поведения была выше у доминантов по сравнению с субординантами (рис. 14). У них также была выше интенсивность агрессии и обонятельных контактов, сопровождающих конкуренцию за пищу и полового партнера. Таким образом, социальный ранг является высоко устойчивой характеристикой особи, которая сохраняется в конкурентных отношениях за пищу и полового партнера, а также в маркирующем поведении. Разработанная модель может являться эффективным инструментом при генетическом анализе социальной иерархии - явлении, чрезвычайно широко распространенном в животном мире. (Приоритетное направление РАН - 5.14.; Программа СО РАН - 21.3.; ИЦиГ СО РАН).

Рис. 14. Устойчивая ранговая асимметрия в различных видах социальных взаимодействий в этологической модели социального доминирования с минимальным социумом у самцов лабораторных мышей. Межранговые различия отмечены звездочками, *** p < 0.001.